非自然发生的5’-非转译区及3’-非转译区及其用途的制作方法

本揭示涉及非自然发生的5’-非转译区及3’-非转译区及其用途。

背景技术：

1、核酸疫苗使用由dna或rna编码的抗原。dna疫苗一般而言包括插入细菌质体的抗原编码基因，其由真核启动子调节。另一方面，rna疫苗使用讯息rna(mrna)或其他抗原编码的rna。类似于蛋白疫苗，核酸疫苗可经由各种途径递输，例如肌肉、皮下、粘膜或经皮途径。

2、dna疫苗已知诱发出比胜肽疫苗、细胞疫苗、病毒载体疫苗及rna疫苗更弱的免疫反应。除了具有低免疫原性之外，dna疫苗可能被插入宿主基因体中以诱发肿瘤形成。因此，需要基于rna的疫苗。

技术实现思路

1、技术挑战

2、一实施例提供一分离的多核苷酸，其包括编码非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)的核苷酸序列、编码3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列或其组合。

3、另一实施例提供rna，其可通过使用第一实施例的多核苷酸作为模板转录而获得。

4、另一实施例提供一分离的多核苷酸，其包括非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)核苷酸序列、3’-非转译区(3’-utr)核苷酸序列或其组合。

5、另一实施例提供一获得rna的方法，其包括以多核苷酸作为模板将rna转录。

6、另一实施例提供一获得多胜肽的方法，其包括将通过上述方法获得的rna转译。

7、另一实施例提供一组合物，其包括递输多核苷酸至受试者的多核苷酸。

8、另一实施例提供一组合物，其包括诱发对多核苷酸的免疫反应的多核苷酸。

9、另一实施例提供一使用多核苷酸的方法，其包括将多核苷酸导入宿主细胞中。

10、解决问题的手段

11、如本文所用，用于与多胜肽或多核苷酸有关的术语“一致性”意指通过比较序列而确定至少两个多胜肽序列或多核苷酸序列之间的关系。一致性表示通过胺基酸残基列或核苷酸残基列之间的许多匹配而确定的序列相关性水平。相关的多胜肽或多核苷酸的一致性可通过已知的方法计算。当应用于多胜肽或多核苷酸时，术语“％一致性”定义为在将候选胺基酸序列或核苷酸序列与第二序列比对以获得最大百分比一致性之后，候选序列的残基与第二序列的残基一致的百分比，并在需要时导入间隙。用于比对的方法与程式为本领域中已知。所述程式可为，例如，blast、smith-waterman算法或needleman-wunsch算法。

12、如本文所用，“5’-非转译区(5’-utr)”意指不编码多胜肽的mrna区，直接在欲通过核醣体转译的mrna转录本的第一个密码子的上游(亦即，5’)，亦即，起始密码子。

13、如本文所用，“3’-非转译区(3’-utr)”意指不编码多胜肽的mrna区，直接在mrna转录本转译传讯终止的密码子的下游(亦即，3’)，亦即，终止密码子。

14、如本文所用，“开读框(orf)”意指编码多胜肽的dna的连续区，其始于起始密码子，例如，甲硫胺酸密码子(atg)，并止于终止密码子，例如taa、tag或tga。

15、如本文所用，“多腺苷酸序列”或“多(a)尾”意指在3’-utr下游的包括多个连续单磷酸腺苷的mrna区，例如，直接在3’-utr下游(亦即，3’)。多(a)尾可包括10至300个单磷酸腺苷。举例而言，多(a)尾可包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。多(a)尾可包括，例如，50至250个单磷酸腺苷。活体(例如细胞或受试者)中的多(a)尾可用于保护mrna免于酵素(例如，细胞质中的酵素)攻击，并有助于终止转录、从细胞核输出mrna及转译。

16、如本文所用，术语“可操作地连接”意指在单一核酸片段上连接各核苷酸序列，使得一功能受另一者的影响。举例而言，当启动子能影响编码序列的表达时(亦即，当通过启动子调节编码序列的转录时)，启动子可操作地连接至编码序列(例如，orf)。编码序列可以正义或反义方向可操作地连接至调节序列。

17、如本文所用，除非另有指明核苷酸序列的位置，否则核苷酸序列从5’端连接至3’端或位于5’端至3’端。

18、如本文所用，术语“载体”或“核酸构筑体”意指可携带基因、orf或dna片段进入细胞的任意核酸。载体可为，例如，可在细胞中复制的载体。载体可为病毒、噬菌体、原病毒、质体、噬菌体载体(phagemid)、转位子或人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或植物人工染色体(plac)。

19、第一实施例提供一分离的多核苷酸，其包括编码非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)的核苷酸序列、编码3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列或其组合。

20、分离的多核苷酸可包括编码非自然发生的5’-utr的核苷酸序列及编码非自然发生的3’-utr的核苷酸序列。分离的多核苷酸可包括编码非自然发生的5’-utr的核苷酸序列及编码自然发生的3’-utr的核苷酸序列。

21、分离的多核苷酸可为聚去氧核糖核苷酸。

22、5’-utr可包括非自然发生的核苷酸序列。5’-utr可与seq id no:1的核苷酸序列具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性。5’-utr可包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或其组合的序列。5’-utr可为多核糖核苷酸。编码非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)的核苷酸序列可包括seq id no:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或其组合的序列。彼等序列可为聚去氧核糖核苷酸。

23、3’-utr可包括非自然发生的或自然发生的核苷酸序列。3’-utr可与seq id no:15的核苷酸序列具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性，并可与seq id no:20的核苷酸序列具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性。3’-utr可包括seq id no:14、15、16、17、18、19、20或其组合的序列。编码非自然发生或自然发生的3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列可包括seq id no:34、35、36、37、38、39、40或其组合。

24、编码非自然发生的或自然发生的3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列可包括限制酶的识别位置。限制酶可包括xhoi、nhei、或xhoi及nhei。

25、编码5’-utr的核苷酸序列可进一步包括可操作地连接至5’-utr的上游启动子区的核苷酸序列。

26、编码5’-utr的核苷酸序列可包括可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列，且可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列可能在编码5’-utr的核苷酸的下游可操作地连接至5’-utr。

27、可转录核苷酸序列可为编码多胜肽或rna的序列。多胜肽可为抗原性多胜肽或治疗性多胜肽。抗原性多胜肽可为病毒抗原性多胜肽。病毒抗原性多胜肽可为至少一β冠状病毒(betacov)抗原性多胜肽、至少一呼吸道融合病毒(rsv)抗原性多胜肽、至少一麻疹病毒(mev)抗原性多胜肽、至少一人类间质肺炎病毒(hmpv)抗原性多胜肽、至少一人类副流感病毒(piv)抗原性多胜肽、其抗原性片段或其组合。betacov可为mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1、其变体或其组合。sars-cov-2发现于2019年，且亦称为covid-19。抗原性多胜肽可为betacov的棘蛋白或其抗原性片段。治疗性多胜肽可为，例如，抗体、激素、细胞激素、酵素、其衍生物或其组合。

28、用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列可为选殖位。选殖位可为多重选殖位。选殖位可包括限制酶的识别位置、切割位置或其组合。

29、可将编码5’-utr的核苷酸序列、可转录核苷酸或用于导入可转录核苷酸的核苷酸序列连接，以在体外或体内转录时形成共同转录本。

30、可将启动子、编码5’-utr的核苷酸序列、可转录核苷酸或用于导入可转录核苷酸的核苷酸序列连接，以在体外或体内转录时形成共同转录本。

31、编码3’-utr的核苷酸序列可进一步包括可操作地连接至3’-utr的下游多腺苷酸或多腺苷酸附着信号(多(a)附着信号)的核苷酸序列。编码3’-utr的核苷酸序列可包括可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列，且可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列可能在编码3’-utr的核苷酸的上游可操作地连接至3’-utr。

32、可将可转录核苷酸、或用于导入可转录核苷酸的核苷酸序列、编码3’-utr的核苷酸序列及多腺苷酸或多腺苷酸附着信号连接，以便在体外或体内转录时形成共同转录本，或在共同转录本的3’-utr下游添加多(a)尾。

33、在多核苷酸中，编码5’-utr的核苷酸序列可包括可转录核苷酸序列或可操作地连接至5’-utr序列的用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列。在5'-utr序列的下游，可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列可操作地连接至5’-utr序列，且编码3’-utr的核苷酸序列可包括可操作地连接至3’-utr的下游多腺苷酸或多腺苷酸附着信号的核苷酸序列，且可能在3’-utr序列的上游可操作地连接至可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列。举例而言，多核苷酸可为其中依序将下列连接的多核苷酸：编码5’-utr的核苷酸序列、编码多胜肽的核苷酸序列或选殖位核苷酸序列、编码3’-utr的核苷酸序列及多腺苷酸或多腺苷酸附着信号核苷酸序列。在多核苷酸中，编码5’-utr的核苷酸序列可包括seq id no:22或31的核苷酸序列，编码3’-utr的核苷酸序列可包括seq id no:40的核苷酸序列，且多腺苷酸的核苷酸序列可包括seq id no:41的核苷酸序列。

34、编码5’-utr的核苷酸序列可包括可操作地连接至5’-utr的上游启动子区的核苷酸序列、可转录核苷酸序列或可操作地连接至启动子的用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列；可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列在5’-utr序列的下游可操作地连接至5’-utr序列；编码3’-utr的核苷酸序列可包括可操作地连接至3’-utr的下游多腺苷酸或多腺苷酸附着信号的核苷酸序列，且可能在3’-utr序列的上游可操作地连接至可转录核苷酸序列或用于导入可转录核苷酸序列的核苷酸序列。举例而言，多核苷酸可为其中依序将下列连接的多核苷酸：启动子、编码5’-utr的核苷酸序列、编码多胜肽的核苷酸序列或选殖位核苷酸序列、编码3’-utr的核苷酸序列及多腺苷酸或多腺苷酸附着信号核苷酸序列。在多核苷酸中，编码5’-utr的核苷酸序列可包括seq id no:22或31的核苷酸序列，编码3’-utr的核苷酸序列可包括seq id no:40的核苷酸序列，且多腺苷酸的核苷酸序列可包括seq id no:41的核苷酸序列。

35、可将编码5’-utr的核苷酸序列、编码多胜肽的核苷酸序列或选殖位核苷酸序列、编码3’-utr的核苷酸序列及多腺苷酸或多腺苷酸附着信号连接，以便在体外或体内转录时形成共同转录本，或在共同转录本的3’-utr下游添加多(a)尾。

36、可将启动子、编码5’-utr的核苷酸序列、编码多胜肽的核苷酸序列或选殖位核苷酸序列、编码3’-utr的核苷酸序列及多腺苷酸或多腺苷酸附着信号连接，以便在体外或体内转录时形成共同转录本，或在共同转录本的3’-utr下游添加多(a)尾。

37、多核苷酸可为核酸构筑体或载体。如本文所用，“多腺苷酸附着信号”意指有助于将多腺苷酸添加至未成熟mrna的核苷酸序列。核酸构筑体或载体可包括表达多核苷酸所需的调节序列。表达可为转录、转译或其组合。核酸构筑体或载体可包括表达构筑体或载体。

38、第二实施例提供了可通过使用第一实施例的多核苷酸作为模板的转录而获得的rna。rna可为mrna。mrna可包括信号序列。mrna可包含任一选自于seq id no:63至76的核苷酸序列。mrna可为其中序列中的至少一u通过n1-甲基-假尿苷取代的mrna。在mrna中，5’端的ga可具有m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)的帽结构。在mrna中，所有的u皆可通过n1-甲基-假尿苷取代。mrna可为其中所有的u皆通过n1-甲基-假尿苷取代的mrna，且5’端的ga具有m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)的帽结构。

39、第三实施例提供了分离的多核苷酸，其包括非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)核苷酸序列、非自然发生或自然发生的3’-非转译区(3’-utr)核苷酸序列或其组合。

40、在第三实施例的多核苷酸中，5’-utr与seq id no:1的核苷酸序列可具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性。5’-utr可包括seq idno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或其组合的序列。编码非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)的核苷酸序列可包括seq id no:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或其组合的序列。

41、3’-utr可为与seq id no:15的核苷酸序列具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性的3’-utr，以及与seq id no:20的核苷酸序列具有70％或以上，例如，80％或以上、90％或以上或95％或以上的序列一致性的3’-utr。3’-utr可包括seq id no:14、15、16、17、18、19、20或其组合的序列。编码非自然发生或自然发生的3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列可包括seq id no:34、35、36、37、38、39、40或其组合的序列。

42、第三实施例的多核苷酸可包括非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)与自然发生的3’-非转译区(3’-utr)。

43、5’-utr核苷酸序列可包括编码多胜肽的核苷酸序列，且编码多胜肽的核苷酸序列可能在5’-utr核苷酸的下游可操作地连接至5’-utr。多胜肽可为抗原性多胜肽或治疗性多胜肽。抗原性多胜肽可为病毒抗原性多胜肽。病毒抗原性多胜肽可为至少一betacov抗原性多胜肽、至少一rsv抗原性多胜肽、至少一mev抗原性多胜肽、至少一hmpv抗原性多胜肽、至少一hpiv抗原性多胜肽、其抗原性片段或其组合。betacov可为mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1、其变体或其组合。抗原性多胜肽可为betacov的棘蛋白或其抗原性片段。betacov的棘蛋白可为sars-cov-2的自然棘蛋白或其变体。变体包括α、β、γ、δ、ε及ο变体。sars-cov-2的自然棘蛋白或sars-cov-2的α、β、γ、δ、ε及ο变体的棘蛋白可分别包含seq id no:42至48的胺基酸序列。治疗性多胜肽可为，例如，抗体、激素、细胞激素、酵素、其衍生物或其组合。

44、5’-utr核苷酸序列及编码多胜肽的核苷酸序列可连接在一共同转录本中。

45、3’-utr核苷酸可进一步包括与其可操作地连接的下游多腺苷酸的核苷酸序列。多腺苷酸的核苷酸序列可包括，例如，20个或以上、40个或以上、80个或以上、或100个或以上，以及500个或以下、400个或以下、300个或以下、200个或以下、或150个或以下的腺苷基核苷酸。

46、3’-utr核苷酸序列可包括编码多胜肽的核苷酸序列，且编码多胜肽的核苷酸序列可能在3’-utr核苷酸序列的上游可操作地连接至3’-utr。编码多胜肽的核苷酸序列可为核糖核苷酸序列，例如，mrna。

47、编码多胜肽的核苷酸序列与3’-utr核苷酸序列可连接在一共同转录本中。

48、5’-utr可包括编码多胜肽的核苷酸序列，且编码多胜肽的核苷酸序列可能在5’-utr序列的下游可操作地连接至5’-utr序列，且3’-utr可包括可操作地连接至3’-utr的下游多腺苷酸的核苷酸序列并可在3’-utr序列的上游连接至编码多胜肽的核苷酸序列。

49、5’-utr核苷酸序列、编码多胜肽的核苷酸序列、3’-utr核苷酸序列及多(a)尾可连接在一共同转录本中。

50、相较于使用自然发生的5’-utr和/或自然发生的3’-utr的情况，5’-utr与3’-utr可具有增加转译效率、编码多胜肽的核苷酸序列的稳定性或其组合的活性。

51、多核苷酸可为rna，例如，mrna。多核苷酸可包括5’端帽。术语“5’端帽”意指出现在mrna分子的5’端的帽结构。5’端帽可包括鸟核苷酸，其通过与5’端的不寻常三磷酸键联而连接至mrna。鸟苷可在7号位置甲基化，且为例如m7g或3’-o-me-m7g。术语“常规5’端帽”表示自然发生的rna 5’端帽，例如，7-甲基鸟苷(m7g)。如本文所用，术语“5’端帽”包括5’端帽类似物，其类似于rna端帽结构并连接至rna，且例如，经修饰以在体内和/或在细胞中具有稳定rna的能力。可通过在5’端帽或5’端帽类似物存在下将dna模板转录及通过以共转录方式将5’端帽或5’端帽类似物插入欲生成的rna链中，或通过使用转录后加帽酵素(例如，牛痘病毒的加帽酵素)生成5’端帽或5’端帽类似物而将5’端帽或5’端帽类似物提供至rna。5’端帽结构可为，例如，7mg(5’)ppp(5’)impnp、3’-o-me-m7g(5’)ppp(5’)g、m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)或m7g(5’)ppp(5’)(2’omea)pg。

52、多核苷酸可为rna，5’-utr核苷酸序列可包含seq id no:1或10的核苷酸序列，3’-utr核苷酸序列可包含seq id no:20的核苷酸序列，且多腺苷酸的核苷酸序列可包含seqid no:101的核苷酸序列。3’-utr可进一步包含限制酶的识别序列。限制酶可包括xhoi、nhei、或xhoi及nhei。

53、在多核苷酸中，至少一u可通过n1-甲基-假尿苷取代。

54、多核苷酸可包含任一选自于seq id no:63至76的核苷酸序列，且多核苷酸中的至少一u可通过n1-甲基-假尿苷取代。在多核苷酸中，每一u可通过n1-甲基-假尿苷取代。

55、此外，多核苷酸的5’端可具有m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)的帽结构。

56、第四实施例提供了获得rna的方法，其包括以第一实施例的多核苷酸作为模板将rna转录。转录可包括体外、离体或体内转录。体内转录可包括在受试者中的转录。rna可为mrna。mrna可包含任一选自于seq id no:63至76的核苷酸序列。mrna可为其中序列中的至少一u通过n1-甲基-假尿苷取代的mrna。在mrna中，5’端的ga可具有m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)的帽结构。在mrna中，所有的u皆可通过n1-甲基-假尿苷取代。mrna可为其中所有的u皆通过n1-甲基-假尿苷取代的mrna，且5’端的ga具有5’-[1,2-[(3’-o-甲基)m7g-(5’→5’)-ppp-am]]的帽结构。在结构中，am表示2’-o-甲基腺苷。然而，mrna的5’端帽结构不局限于此结构，并可通过本领域中已知的自然发生的5’端帽结构或5’端帽类似物取代。

57、术语“体外转录”或“rna体外转录”意指在非细胞系统中(亦即，在体外)合成rna(包括mrna)的过程。选殖载体dna(包括质体dna载体)可用作生成rna转录本的模板。彼等选殖载体一般而言亦称为转录载体。rna可通过dna依赖性体外转录以适当dna模板获得。dna模板可为线性化质体dna模板。调节rna体外转录的启动子可为用于dna依赖性rna聚合酶的任意启动子。dna依赖性rna聚合酶可为t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶或其组合。可通过将核酸选殖并将其导入载体中而获得用于rna体外转录的dna模板，以进行rna体外转录。dna可包括cdna，其对应于欲在体外转录的各rna。用于rna体外转录的载体可为环状质体dna。cdna可通过mrna的反转录或通过化学合成而获得。

58、转录载体可包括启动子、编码5’-utr的核苷酸序列、编码多胜肽的序列(例如，开读框(orf))、编码3’-utr的核苷酸序列及多(a)尾。编码5’-utr的核苷酸序列可包含至少一选自于seq id no:22至33的核苷酸序列。编码3’-utr的核苷酸序列可包含至少一选自于seq id no:34至40的核苷酸序列。转录载体亦可包括大肠杆菌复制起点cole1 ori、选择标记基因或其组合。启动子可为t7启动子。选择标记可为抗生素抗性酵素，例如，康霉素抗性酵素。

59、体外转录可包括通过将转录载体导入宿主细胞(例如，大肠杆菌)中而获得转形的宿主细胞，并通过培养宿主细胞而将含有质体dna(其成为mrna的模板)的宿主细胞增生。体外转录可包括从增生的宿主细胞(例如，大肠杆菌)中分离质体dna。质体dna的分离可包括从培养物中分离细胞，并从细胞中分离质体dna。细胞的分离可通过离心、分离、沉淀或其组合进行。可通过碱萃取法、亲和性层析术、高效能液相层析术(hplc)、电泳法或其组合从细胞中分离质体dna。

60、获得rna的方法可包括通过培养包括第一实施例的多核苷酸的细胞而产生多核苷酸的rna转录本。rna转录本可为mrna。mrna可包含任一选自于seq id no:63至76的核苷酸序列。mrna可为其中序列中的至少一u通过n1-甲基-假尿苷取代的mrna。在mrna中，5’端的ga可具有5’-[1,2-[(3’-o-甲基)m7g-(5’→5’)-ppp-am]]的帽结构。在mrna中，所有的u皆可通过n1-甲基-假尿苷取代。在mrna中，所有的u皆可通过n1-甲基-假尿苷取代，且5’端的ga可具有5’-[1,2-[(3’-o-甲基)m7g-(5’→5’)-ppp-am]]的帽结构。然而，mrna的5’端帽结构不局限于此结构，并可通过本领域中已知的自然发生的5’端帽结构或5’端帽类似物取代。

61、第五实施例提供了获得多胜肽的方法，其包括将第三实施例的rna或通过第四实施例的方法获得的rna转译。第三实施例的rna或通过第四实施例的方法获得的rna可为，例如，mrna。

62、所述方法可包括通过培养包括第一实施例的多核苷酸的细胞而产生多胜肽。

63、第六实施例提供了用于将包括第三实施例的多核苷酸的多胜肽导入受试者中的组合物。第三实施例的多核苷酸可为rna，例如，mrna。第三实施例的多核苷酸可为通过第四实施例的方法获得的rna。

64、第七实施例提供了用于诱发对多胜肽的免疫反应的组合物，其包括以第三实施例的多核苷酸作为活性成分。第三实施例的多核苷酸可为rna，例如，mrna。第三实施例的多核苷酸可为通过第四实施例的方法获得的rna。

65、在第六实施例与第七实施例中，组合物可用于提供免疫原性或用于治疗疾病。根据所选的多胜肽，疾病可能不同。疾病可为，例如，由病毒或外来细胞引起的感染、癌症、代谢疾病、发炎性疾病、胃肠道疾病、内分泌疾病、败血症或自体免疫疾病。疾病可由酵素缺乏引起，如亨特症候群(hunter syndrome)、高歇氏病(gaucher disease)及法布里氏病(fabry disease)的情况，并可以酵素替代疗法治疗。在疾病中，外来细胞可为原核细胞或真核细胞。外来细胞可为细菌。

66、多核苷酸可包括编码多胜肽的核苷酸序列。多胜肽可为抗原性多胜肽或治疗性多胜肽。抗原性多胜肽可为病毒抗原性多胜肽。病毒抗原性多胜肽可为至少一betacov抗原性多胜肽、至少一rsv抗原性多胜肽、至少一mev抗原性多胜肽、至少一hmpv抗原性多胜肽、至少一hpiv抗原性多胜肽、其抗原性片段或其组合。betacov可为mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1、其变体或其组合。抗原性多胜肽可为betacov的棘蛋白或其抗原性片段。治疗性多胜肽可为，例如，抗体、激素、细胞激素、酵素、其衍生物或其组合。组合物可用于预防、治疗或诊断受试者的症状或感染。受试者可为哺乳动物，包括人类。感染可为细菌或病毒感染。病毒可为betacov、rsv、mev、hmpv或hpiv。betacov可为mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1、其变体或其组合。组合物可用于启动免疫效应子细胞。举例而言，组合物可用于离体活化周边血液单核细胞(pbmc)，并输入受试者体内。组合物可用于诱发对sars-cov-2或其变体的免疫反应。组合物可用于预防通过sars-cov-2或其变体的感染。

67、组合物可注射至受试者体内，且rna多核苷酸(例如，mrna)可在体内转译以产生抗原性多胜肽。

68、一“有效量”的组合物，其包括具有至少一编码抗原性多胜肽的可转译区的多核苷酸，可与细胞、组织或受试者接触。

69、有效量可根据标靶组织、标靶细胞、投予方式、多核苷酸的物理性质(例如，多核苷酸的大小与多核苷酸中修饰的核苷的量)及组合物的其他组分而确定。一般而言，一有效量的组合物可导致诱发的或增强的免疫反应，以作为细胞中抗原产生的功能。

70、组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起投予。预防性或治疗性化合物可为，例如，佐剂或追加剂。如本文所用，当提及预防性组合物(例如疫苗)时，术语“追加剂”意指额外投予预防性组合物。追加剂或追加剂疫苗可在早期投予预防性组合物之后给予。初始投予预防性组合物与投予追加剂之间的时间可为1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。此外，组合物可不包括佐剂。

71、组合物可经由肌内途径、皮下途径、皮内途径、鼻内途径或肺部途径投予。

72、组合物可包括至少一药学上可接受的赋形剂。组合物中的多核苷酸可与赋形剂一起配制或可与赋形剂一起制成复合物。赋形剂可为本领域中已知。

73、如本文所用，术语“活性成分”意指组合物或其中包含的多核苷酸，例如，rna多核苷酸，包括mrna。rna多核苷酸可为，例如，编码抗原性多胜肽或治疗性多胜肽。

74、组合物中包含的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或其他额外组分的相对量可取决于欲治疗的受试者的身份与大小和/或投予条件与途径而变。举例而言，组合物可包括0.1％至100％，例如，0.5％至50％、1.0％至30％、5.0％至80％或80％(w/w)或以上的活性成分。

75、在组合物中，多核苷酸可为mrna。mrna可包括稳定元件，稳定元件包括5’-utr和/或3’-utr。mrna可进一步包括额外的结构，例如5’端帽结构或3’端多(a)尾。5’-utr与3’-utr一般从基因体dna转录，且为未成熟mrna的元件。成熟mrna的结构特征(例如5’端帽与3’端多(a)尾)一般而言在mrna加工过程中被添加至转录的(未成熟)mrna。多(a)尾为一段腺嘌呤核苷酸，一般而言被添加至转录的mrna。多(a)尾可包括，例如，400个或以下的腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一段3’端多(a)尾可为单独mrna的稳定性的基本元件。

76、组合物可配制成纳米颗粒。纳米颗粒可用于将多核苷酸(例如mrna)递输至细胞中，且为本领域中已知。举例而言，纳米颗粒可为用于疫苗(例如，rna疫苗)的已知纳米颗粒，以诱发对covid-19的免疫反应。纳米颗粒可为脂质纳米颗粒(lnp)。组合物可配制成脂质纳米颗粒(lnp)或可结合至lnp。所述结合可以包括lnp内的结合或lnp表面的结合。举例而言，组合物可配制在脂质多阳离子复合物内部或可结合至脂质多阳离子复合物。脂质多阳离子复合物亦称为阳离子脂质纳米颗粒。多阳离子可包括mc3、lipid 319、c12-200、5a2-sc8、306oi10、moderna lipid 5、acuitas a9、sm-102、alc-0315、arcturus lipid 2,2(8,8)4c ch3、genevant cl1、阳离子多胜肽，例如聚离胺酸、聚鸟胺酸和/或聚精胺酸。此外，组合物可配制在脂质纳米颗粒内部或结合至脂质纳米颗粒，脂质纳米颗粒包括非阳离子脂质，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、固醇(例如胆固醇)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。此外，组合物可配制在脂质纳米颗粒内部或结合至脂质纳米颗粒，其包括聚乙二醇(peg)-脂质，例如1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(peg2000-dmg)、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四基乙酰胺(alc-0159)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(peg-dma)。

77、脂质纳米颗粒制剂可包括阳离子脂质、磷脂质、固醇(例如胆固醇)、peg-脂质或其组合。脂质纳米颗粒制剂可包括，例如，阳离子脂质、磷脂质、固醇(例如胆固醇)及peg-脂质。此外，脂质纳米颗粒可包括peg-修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可离子化脂质或其组合。脂质纳米颗粒可包括0.5摩尔％至15摩尔％的peg-修饰的脂质、5摩尔％至25摩尔％的非阳离子脂质、25摩尔％至55摩尔％的固醇及20摩尔％至60摩尔％的可离子化脂质。peg-修饰的脂质可为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(peg2000-dmg)，非阳离子脂质可为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，固醇可为胆固醇，且可离子化阳离子脂质可为下列化合物1的结构：

78、

79、peg-修饰的脂质可为下列化合物2(alc-0159)的结构，非阳离子脂质可为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，固醇可为胆固醇，且可离子化的阳离子脂质可为下列化合物3(alc-0315)的结构：

80、

81、组合物可为用于诱发对sars-cov-2或其变体的免疫反应的组合物，其包括多核苷酸及脂质纳米颗粒(lnp)，以作为活性成分。组合物可用于预防sars-cov-2或其变体的感染。

82、第八实施例提供了使用多核苷酸的方法，其包括将多核苷酸导入宿主细胞中。第三实施例的多核苷酸可为rna，例如，mrna。第三实施例的多核苷酸可为rna，例如，mrna。

83、在所述方法中，多核苷酸可为rna，其包括mrna。宿主细胞可为任何衍生自受试者的细胞。受试者可为哺乳动物，包括人类。细胞可为，例如，干细胞、生殖细胞或体细胞。在上述方法中，多核苷酸可为rna，且宿主细胞可为抗原提供细胞，其包括树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

84、所述方法可包括将第三实施例的多核苷酸注射至受试者体内。投予可为非口服或口服投予。投予可为肌内、皮下、皮内、鼻内或肺部投予。受试者可为哺乳动物，包括人类。

85、所述方法可使受试者对多胜肽免疫。此外，所述方法可治疗受试者的疾病。多胜肽可为betacov的抗原蛋白。betacov可为mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1、其变体或其组合。所述方法可在受试者体内诱发对betacov(例如，对其棘蛋白或其变体或次单元)的免疫反应。所述方法可预防感染betacov，例如，mers-cov、sars-cov、sars-cov-2、hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-nl、hcov-nh、hcov-hku1或其变体或组合。

86、在第三至第八实施例中，多核苷酸可包括5’端帽。5’端帽可为7mg(5’)ppp(5’)impnp、3’-o-me-m7g(5’)ppp(5’)g或m7g(5’)ppp(5’)(2’omea)pg。

87、在第三至第七实施例中，多核苷酸可包括具有至少一化学修饰的核苷酸。修饰可在整个核苷酸中一致地进行。如本文所用，“化学修饰”与“化学上修饰”意指腺苷(a)、鸟苷(g)、尿苷(u)、胸腺嘧啶(t)或胞苷(c)的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸的位置、样式、百分比或群体的至少一修饰。一般而言，彼等术语并非意指mrna帽部分的自然发生的5’端中的核糖核苷酸的修饰。

88、多核苷酸，例如rna(包括mrna)，可包括一或多个其他修饰。多核苷酸的特定区域可包括核苷或核苷酸的至少一修饰。当导入细胞或受试者中时，相较于未修饰的多核苷酸，修饰的多核苷酸在细胞或受试者中可显示降解减少。此外，当导入细胞或受试者中时，相较于未修饰的多核苷酸，修饰的多核苷酸在细胞或受试者中可显示免疫原性降低(例如，先天反应降低)。

89、具有修饰的胞嘧啶的核苷可包括n4-乙酰基-胞苷(ac4c)、5-甲基-胞苷(m5c)、5-卤-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5c)、1-甲基-假异胞苷、2-硫-胞苷(s2c)、2-硫-5-甲基-胞苷或其组合。

90、具有修饰的腺嘌呤的核苷可包括7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1a)、2-甲基-腺嘌呤(m2a)、n6-甲基-腺苷(m6a)或其组合。

91、具有修饰的鸟嘌呤的核碱基或核苷可包括肌苷(i)、1-甲基-肌苷(m1i)、怀俄苷(wyosine(img))、甲基怀俄苷(mimg)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preq0)、7-胺基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preq1)、7-甲基-鸟苷(m7g)、1-甲基-鸟苷(m1g)、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷或其组合。

92、具有化学修饰的核苷酸可为假尿苷、n1-甲基假尿苷、n1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷、2’-o-甲基尿苷或其组合。化学修饰可位于尿嘧啶的第5号位置。化学修饰可为将尿嘧啶修饰成n1-甲基假尿苷。化学修饰可为将尿嘧啶修饰成n1-乙基假尿苷。

93、本发明的效果

94、根据一实施例的分离的多核苷酸，其包括编码非自然发生的5’-非转译区(5’-utr)的核苷酸序列、编码非自然发生或自然发生的3’-非转译区(3’-utr)的核苷酸序列或其组合，可用于稳定mrna，从而增加转译效率。

95、根据另一实施例的rna相当稳定并具有高转译效率，因此，可用于有效地转译rna。

96、根据一实施例的分离的多核苷酸相当稳定并具有高转译效率，因此，可用于有效地转译rna。

97、当使用根据另一实施例而获得rna的方法时，可有效地获得rna。

98、当使用根据另一实施例而获得多胜肽的方法时，可有效地获得多胜肽。

99、根据另一实施例的免疫原性组合物可用于有效地使受试者免疫。

100、使用根据另一实施例的多核苷酸的方法可用于有效地使受试者免疫。