II类V型CRISPR系统的制作方法

背景技术：

1、cas酶以及其相关的成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)向导核糖核酸(rna)似乎是原核免疫系统的普遍(约45％的细菌，约84％的古细菌)组分，用于通过crispr-rna向导的核酸切割来保护此类微生物免受非自身核酸的侵害，如传染性病毒和质粒。虽然编码crisprrna元件的脱氧核糖核酸(dna)元件在结构和长度上可能相对保守，但其crispr相关(cas)蛋白是高度多样化的，含有多种核酸相互作用结构域。虽然早在1987年就观察到crispr dna元件，但crispr/cas复合物的可编程核酸内切酶切割能力直到最近才被认识到，从而引起重组crispr/cas系统在各种dna操纵和基因编辑应用中的使用。

2、序列表

3、本技术含有已经以ascii格式电子提交的序列表，并且特此通过全文引用的方式并入。创建于2021年3月5日的所述ascii副本命名为55921-728_601_sl.txt并且大小为23,886,645字节。

技术实现思路

1、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶包含ruvc结构域，其中所述核酸内切酶衍生自未培养的微生物，并且其中所述核酸内切酶是cas12a核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列。在一些实施例中，所述cas12a核酸内切酶包括序列gwxxxk。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括ucuac[n3-5]guagau(n4)。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括ccugc[n4]gcagg(n3-4)。在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括ruvci、ii或iii结构域。在一些实施例中，所述核酸内切酶与seq id no：1-3470中的任一者或其变体的ruvci、ii或iii结构域具有至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性。在一些实施例中，所述ruvci结构域包括d催化残基。在一些实施例中，所述ruvcii结构域包括e催化残基。在一些实施例中，所述ruvciii结构域包括d催化残基。在一些实施例中，所述ruvc结构域不具有核酸酶活性。在一些实施例中，所述核酸内切酶进一步包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体的wed ii结构域具有至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的wed ii结构域。在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶被配置成与包括seq id no：3862-3913中的任一者的原间隔子相邻基序(pam)序列结合，其中所述核酸内切酶是2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶进一步包括锌指状结构域。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-355mg11、mg13、mg19、mg20、mg26、mg28、mg29、mg30、mg31、mg32、mg37、9、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)工程化向导rna，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735或3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列，以及(b)2类v型cas核酸内切酶，所述2类v型cas核酸内切酶被配置成与所述工程化向导rna结合。在一些实施例中，所述核酸内切酶被配置成与包括seq id no：3863-3913中的任一者的原间隔子相邻基序(pam)序列结合。在一些实施例中，所述向导rna包括与真核、真菌、植物、哺乳动物或人基因组多核苷酸序列互补的序列。在一些实施例中，所述向导rna的长度为30-250个核苷酸。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括接近核酸内切酶的n末端或c末端的一个或多个核定位序列(nls)。在一些实施例中，所述nls包括与来自由seq id no：3938-3953组成的组的序列至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括以下突变中的至少一个突变：当所述核酸内切酶的序列与seqid no：215最佳比对时，s168r、e172r、n577r或y170r。在一些实施例中，当所述核酸内切酶的序列与seq id no：215最佳比对时，所述核酸内切酶包括所述突变s168r和e172r。在一些实施例中，当所述核酸内切酶的序列与seq id no：215最佳比对时，所述核酸内切酶包括所述突变n577r或y170r。在一些实施例中，当所述核酸内切酶的序列与seq id no：215最佳比对时，所述核酸内切酶包括所述突变s168r。在一些实施例中，所述核酸内切酶不包括e172、n577或y170的突变。在一些实施例中，所述工程化核酸酶系统进一步包括

2、单链或双链dna修复模板，所述单链或双链dna修复模板从5′至3′包括：第一同源臂，所述第一同源臂包括位于靶脱氧核糖核酸序列的5′的至少20个核苷酸的序列；至少10个核苷酸的合成dna序列；以及第二同源臂，所述第二同源臂包括位于靶序列的3′的至少20个核苷酸的序列。在一些实施例中，所述第一同源臂或所述第二同源臂包括至少40个、80个、120个、150个、200个、300个、500个或1,000个核苷酸的序列。在一些实施例中，所述第一同源臂或所述第二同源臂与原核生物、细菌、真菌或真核生物的基因组序列同源。在一些实施例中，所述单链或双链dna修复模板包括转基因供体。在一些实施例中，所述工程化核酸酶系统进一步包括包含侧接一个或两个单链dna区段的双链dna区段的dna修复模板。在一些实施例中，所述单链dna区段与所述双链dna区段的5′端缀合。在一些实施例中，所述单链dna区段与所述双链dna区段的3′端缀合。在一些实施例中，所述单链dna区段的长度为4至10个核苷酸碱基。在一些实施例中，所述单链dna区段具有与间隔子序列内的序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，双链dna序列包括条形码、开放阅读框、增强子、启动子、蛋白质编码序列、mirna编码序列、rna编码序列或转基因。在一些实施例中，双链dna序列侧接核酸酶切割位点。在一些实施例中，所述核酸酶切割位点包括间隔子和pam序列。在一些实施例中，所述系统进一步包括mg2+的来源。在一些实施例中，所述向导rna包括包含至少8个、至少10个或至少12个碱基配对的核糖核苷酸的发夹。在一些实施例中，所述发夹包括10个碱基配对的核糖核苷酸。在一些实施例中：(a)所述核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1721中的任一者或其变体至少75％、80％或90％相同的序列；以及(b)向导rna结构包括与seq id no：3608-3609、3853或3851-3857中的任一者的非简并核苷酸至少80％或90％相同的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶被配置成与包括seq id no：3863-3913中的任一者的pam结合。在一些实施例中，所述核酸内切酶被配置成与包括seqid no：3871的pam结合。在一些实施例中，所述序列同一性是通过blastp、clustalw、muscle、mafft算法或clustalw算法使用史密斯-沃特曼同源性搜索算法参数来确定的。在一些实施例中，所述序列同一性是通过blastp同源性搜索算法使用字长(w)为3、期望值(e)为10的参数以及blosum62评分矩阵将空位罚分设置为存在为11，扩展为1并且使用条件组成评分矩阵调整来确定的。

3、在一些方面，本公开提供了一种工程化向导rna，其包括：(a)dna靶向区段，所述dna靶向区段包括与靶dna分子中的靶序列互补的核苷酸序列；以及(b)蛋白质结合区段，所述蛋白质结合区段包括杂交以形成双链rna(dsrna)双链体的两个互补核苷酸延伸段，其中所述两个互补核苷酸延伸段与中间核苷酸彼此共价连接，并且其中所述工程化向导核糖核酸多核苷酸能够与核酸内切酶形成与seq id no：1-3470中的任一者具有至少75％序列同一性的复合物，并且将所述复合物靶向所述靶dna分子的所述靶序列。在一些实施例中，所述dna靶向区段位于两个互补核苷酸延伸段中的两个互补核苷酸延伸段的3′处。在一些实施例中，蛋白质结合区段蛋白质结合区段包括与seq id no：3608-3609的非简并核苷酸具有至少70％、至少80％或至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述双链rna(dsrna)双链体包括至少5个、至少8个、至少10个或至少12个核糖核苷酸。

4、在一些方面，本公开提供了一种脱氧核糖核酸多核苷酸，其编码本文所描述的工程化向导核糖核酸多核苷酸。

5、在一些方面，本公开提供了一种核酸，其包括为在生物体中表达而优化的工程化核酸序列，其中所述核酸编码2类v型cas核酸内切酶，并且其中所述核酸内切酶衍生自未培养的微生物，其中所述生物体不是所述未培养的生物体。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者具有至少70％或至少80％序列同一性的变体。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括编码接近核酸内切酶的n末端或c末端的一个或多个核定位序列(nls)的序列。在一些实施例中，所述nls包括选自seq id no：3938-3953的序列。在一些实施例中，所述nls包括seq id no：3939。在一些实施例中，所述nls接近所述核酸内切酶的n末端。在一些实施例中，所述nls包括seq id no：3938。在一些实施例中，所述nls接近所述核酸内切酶的c末端。在一些实施例中，所述生物体是原核生物、细菌、真核生物、真菌、植物、哺乳动物、啮齿动物或人。

6、在一些方面，本公开提供了一种工程化载体，其包括编码2类v型cas核酸内切酶或cas12a核酸内切酶的核酸序列，其中所述核酸内切酶衍生自未培养的微生物。

7、在一些方面，本公开提供了一种工程化载体，其包括本文所描述的核酸。

8、在一些方面，本公开提供了一种工程化载体，其包括本文所描述的脱氧核糖核酸多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是质粒、微环、celid、腺相关病毒(aav)源性病毒体、慢病毒或腺病毒。

9、在一些方面，本公开提供了一种细胞，其包括本文所描述的载体。

10、在一些方面，本公开提供了一种产生核酸内切酶的方法，所述方法包括培养本文所描述的宿主细胞中的任何宿主细胞。

11、在一些方面，本公开提供了一种用于结合、切割、标记或修饰双链脱氧核糖核酸多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)使所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸和与被配置成与所述核酸内切酶和所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸结合的工程化向导rna复合的2类v型cas核酸内切酶接触；(b)其中所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸包括原间隔子相邻基序(pam)；并且(c)其中所述pam包括包含seq id no：3863-3913中的任一者的序列。在一些实施例中，所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸包括第一链和第二链，所述第一链包括与所述工程化向导rna的序列互补的序列，并且所述第二链包括所述pam。在一些实施例中，所述pam直接邻近与所述工程化向导rna的所述序列互补的序列的5′端。在一些实施例中，所述pam包括seqid no：3871。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶衍生自未培养的微生物。在一些实施例中，所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸是真核生物、植物、真菌、哺乳动物、啮齿动物或人双链脱氧核糖核酸多核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括向靶核酸基因座递送本文所描述的工程化核酸酶系统，其中核酸内切酶被配置成与工程化向导核糖核酸结构形成复合物，并且其中所述复合物被配置成使得在所述复合物与所述靶核酸基因座结合时，所述复合物修饰所述靶核酸基因座。在一些实施例中，修饰所述靶核酸基因座包括结合、切开、切割或标记所述靶核酸基因座。在一些实施例中，所述靶核酸基因座包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。在一些实施例中，所述靶核酸包括基因组dna、病毒dna、病毒rna或细菌dna。在一些实施例中，所述靶核酸基因座在体外。在一些实施例中，所述靶核酸基因座在细胞内。在一些实施例中，所述细胞是原核细胞、细菌细胞、真核细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞或原代细胞。在一些实施例中，所述细胞是原代细胞。在一些实施例中，所述原代细胞是t细胞。在一些实施例中，所述原代细胞是造血干细胞(hsc)。在一些实施例中，将所述工程化核酸酶系统递送到所述靶核酸基因座包括递送本文所描述的核酸或本文所描述的载体。在一些实施例中，将所述工程化核酸酶系统递送到所述靶核酸基因座包括递送包括编码所述核酸内切酶的开放阅读框的核酸。在一些实施例中，所述核酸包括编码所述核酸内切酶的所述开放阅读框可操作地连接的启动子。在一些实施例中，将所述工程化核酸酶系统递送到所述靶核酸基因座包括递送含有编码所述核酸内切酶的所述开放阅读框的封端mrna。在一些实施例中，将所述工程化核酸酶系统递送到所述靶核酸基因座包括递送翻译的多肽。在一些实施例中，将所述工程化核酸酶系统递送到所述靶核酸基因座包括递送编码与核糖核酸(rna)poliii启动子可操作地连接的所述工程化向导rna的脱氧核糖核酸(dna)。在一些实施例中，所述核酸内切酶在所述靶基因座处或附近诱导单链断裂或双链断裂。在一些实施例中，所述核酸内切酶诱导所述靶基因座内或与位于所述靶基因座3′处的交错的单链断裂。

12、在一些方面，本公开提供了一种编辑细胞中的trac基因座的方法，所述方法包括与使所述细胞与以下接触：(a)rna向导的核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述trac基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4316-4369中的任一者的至少18个连续核苷酸具有至少85％的同一性的靶向序列。在一些实施例中，所述rna向导的核酸酶是cas核酸内切酶。在一些实施例中，所述cas核酸内切酶是2类v型cas核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括包含ruvci子结构域、ruvcii子结构域和ruvciii子结构域的ruvc结构域。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna进一步包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735和3851-3857中的任一者的非简并核苷酸中的至少19个非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1721中的任一者或其变体至少75％、80％或90％相同的序列。在一些实施例中，向导rna结构包括与seq id no：3608-3609、3853或3851-3857中的任一者的非简并核苷酸中的至少19个非简并核苷酸至少80％或至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括与所述细胞接触或向所述细胞中引入供体核酸，所述供体核酸包括侧接于3′或5′端上的与seq id no：4424或4425中的任一者具有至少80％同一性的序列的货物序列。在一些实施例中，所述细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施例中，所述细胞是t细胞或其前体或造血干细胞(hsc)。在一些实施例中，所述货物序列包括编码t细胞受体多肽、car-t多肽或其片段或衍生物的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4370-4423中的任一者具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括来自表5a的包括表5a中列出的对应化学修饰的sgrna 1-54的核苷酸序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4334、4350或4324中的任一者具有至少80％序列同一性的靶向序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4388、4404或4378中的任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括来自表5a的sgrna 9、35或19的核苷酸序列。

13、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)rna向导的核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括以下修饰中的至少一个修饰：(i)所述工程化向导rna的5′端的前4个碱基内或所述工程化向导rna的3′端的最后4个碱基内的至少一个核苷酸的2′-o甲基或2′-氟碱基修饰；(ii)所述工程化向导rna的5′端的前五个碱基中的至少2个碱基之间的硫代磷酸酯(ps)键，或所述工程化向导rna的3′端的最后五个碱基中的至少两个碱基之间的硫代磷酸酯键；(iii)所述工程化向导rna的3′茎或5′茎内的硫代磷酸酯键；(iv)所述工程化向导rna的3′茎或5′茎内的2′-o甲基或2′碱基修饰；(v)所述工程化向导rna的间隔子区的至少7个碱基的2′-氟碱基修饰；以及(vi)所述工程化向导rna的环区内的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的5′端的前5个碱基或所述工程化向导rna的3′端的最后5个碱基内的至少一个核苷酸的2′-o甲基或2′-氟碱基修饰。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括在所述工程化向导rna的5′端或所述工程化向导rna的3′端处的2′-o甲基或2′-氟碱基修饰。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的5′端的前五个碱基中的至少2个碱基之间的硫代磷酸酯(ps)键，或所述工程化向导rna的3′端的最后五个碱基中的至少两个碱基之间的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的3′茎或5′茎内的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的3′茎或5′茎内的2′-o甲基碱基修饰。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的间隔子区的至少7个碱基的2′-氟碱基修饰。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述工程化向导rna的环区内的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括在所述工程化向导rna的所述5′端处的至少三个2′-o甲基或2′-氟碱基、所述工程化向导rna的所述5′端的前3个碱基之间的两个硫代磷酸酯键、在所述工程化向导rna的所述4′端处的至少4个2′-o甲基或2′-氟碱基，以及所述工程化向导rna的所述3′端的最后三个碱基之间的三个硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括在所述工程化向导rna的5′端处的至少两个2′-o-甲基碱基和至少两个硫代磷酸酯键，以及在所述工程化向导rna的3′端处的至少一个2′-o-甲基碱基和至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括在所述工程化向导rna的所述3′茎区或所述5′茎区两者中的至少一个2′-o-甲基碱基。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括所述间隔子区中的至少一个至至少十四个2′-氟碱基，不包括所述工程化向导rna的种子区。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括在所述工程化向导rna的所述5′茎区中的至少一个2′-o-甲基碱基和所述间隔子区中的至少一个至至少十四个2′-氟碱基，不包括所述向导rna的种子区。在一些实施例中，所述向导rna包括靶向vegf-a基因的间隔子序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3985具有至少80％同一性的间隔子序列。在一些实施例中，所述向导rna包括来自表7的包括表7中列出的化学修饰的向导rna 1-7的核苷酸。在一些实施例中，所述rna向导的核酸酶是cas核酸内切酶。在一些实施例中，所述cas核酸内切酶是2类v型cas核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括包含ruvci子结构域、ruvcii子结构域和ruvciii子结构域的ruvc结构域。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1721中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735和3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3608-3609、3853或3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。

14、在一些方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包括编码与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的异源性核酸内切酶的开放阅读框。在一些实施例中，所述核酸内切酶与seq id no：141、215、229、261或1711-1721中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性。在一些实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞是λde3溶素原，或者所述大肠杆菌细胞是bl21(de3)菌株。在一些实施例中，所述大肠杆菌细胞具有ompt lon基因型。在一些实施例中，所述开放阅读框与以下可操作地连接：t7启动子序列、t7-lac启动子序列、lac启动子序列、tac启动子序列、trc启动子序列、parabad启动子序列、prhabad启动子序列、t5启动子序列、cspa启动子序列、arapbad启动子、来自噬菌体λ的强向左启动子(pl启动子)或其任何组合。在一些实施例中，所述开放阅读框包括编码使用相同读框与编码所述核酸内切酶的序列连接的亲和标签的序列。在一些实施例中，所述亲和标签是固定化金属亲和色谱法(imac)标签。在一些实施例中，所述imac标签是聚组氨酸标签。在一些实施例中，所述亲和标签是myc标签、人流感血凝素(ha)标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签、链霉亲和素标签、flag标签或其任何组合。在一些实施例中，所述亲和标签通过编码蛋白酶切割位点的接头序列使用相同读框与编码所述核酸内切酶的所述序列连接。在一些实施例中，所述蛋白酶切割位点是烟草蚀纹病毒(tev)蛋白酶切割位点、蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、因子xa切割位点、肠激酶切割位点或其任何组合。在一些实施例中，所述开放阅读框经密码子优化以在所述宿主细胞中表达。在一些实施例中，所述开放阅读框在载体上提供。在一些实施例中，所述开放阅读框被整合到所述宿主细胞的基因组中。

15、在一些方面，本公开提供了一种培养物，其包括在相容性液体培养基中的本文所描述的宿主细胞中的任何宿主细胞。

16、在一些方面，本公开提供了一种产生核酸内切酶的方法，所述方法包括在相容性生长培养基中培养本文所描述的宿主细胞中的任何宿主细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括诱导核酸内切酶的表达。在一些实施例中，通过添加另外的化学剂或增加量的营养物，或通过升高温度或降低温度来诱导所述核酸酶的表达。在一些实施例中，另外的化学剂或增加量的营养物包括异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)或另外量的乳糖。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养之后分离所述宿主细胞，并且裂解所述宿主细胞以产生蛋白提取物。在一些实施例中，所述方法进一步包括分离所述核酸内切酶。在一些实施例中，所述分离包括使所述蛋白提取物经受imac、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法。在一些实施例中，所述开放阅读框包括编码使用相同读框与编码所述核酸内切酶的序列连接的亲和标签的序列。在一些实施例中，所述亲和标签通过编码蛋白酶切割位点的接头序列使用相同读框与编码所述核酸内切酶的所述序列连接。在一些实施例中，所述蛋白酶切割位点包括烟草蚀纹病毒(tev)蛋白酶切割位点、蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、因子xa切割位点、肠激酶切割位点或其任何组合。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过使对应于所述蛋白酶切割位点的蛋白酶与所述核酸内切酶接触来切割所述亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签是imac亲和标签。在一些实施例中，所述方法进一步包括执行减材imac亲和色谱法以从包括所述核酸内切酶的组合物去除所述亲和标签。

17、在一些方面中，本公开提供了一种系统，其包括：(a)2类v-a型cas核酸内切酶，所述2类v-a型cas核酸内切酶被配置成结合3核苷酸或4核苷酸pam序列，其中所述核酸内切酶相对于smbcas12a具有增加的切割活性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述2类v-a型cas核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与包括靶核酸序列的靶核酸杂交的间隔子序列。在一些实施例中，其中通过将所述核酸内切酶连同相容性向导rna一起引入包括所述靶核酸的细胞并检测所述细胞中所述靶核酸序列的切割来体外测量所述切割活性。在一些实施例中，所述2类v-a型cas核酸内切酶包括与215-225中的任一者或其变体具有至少75％同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述靶核酸进一步包括邻近所述靶核酸序列的yyn pam序列。在一些实施例中，所述2类v-a型cas核酸内切酶相对于smbcas12a具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更多增加的活性。

18、在一些方面，本公开提供了一种系统，其包括：(a)2类v-a′型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna包括与2类v型cas核酸内切酶的天然效应子重复序列的约19至约25个或约19至约31个连续核苷酸具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述天然效应子重复序列是seq id no：3560-3572中的任一者。在一些实施例中，所述2类v-a′型cas核酸内切酶与seq id no：126具有至少75％同一性。

19、在一些方面，本公开提供了一种系统，其包括：(a)2类v-l型核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna包括与2类v型cas核酸内切酶的天然效应子重复序列的约19至约25个或约19至约31个连续核苷酸具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述2类v-l型cas核酸内切酶与seq id no：793-1163中的任一者具有至少75％的序列同一性。

20、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的vegf-a基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述vegf-a基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括与seq id no：3985具有至少80％同一性的靶向序列；或其中所述工程化向导rna包括来自表7的向导rna1-7中的任一者的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq idno：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1721中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735和3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3608-3609、3853或3851-3857中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。

21、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的基因座的方法，所述方法包括使所述细胞与包括以下的组合物接触：(a)2类v型cas核酸内切酶，所述2类v型cas核酸内切酶与seq id no：215-225中的任一者或其变体具有至少75％同一性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述2类v型cas核酸内切酶具有与所述细胞中的spcas9至少等效的切割活性。在一些实施例中，其中通过将所述核酸内切酶连同相容性向导rna一起引入包括所述靶核酸的细胞并检测所述细胞中所述靶核酸序列的切割来体外测量所述切割活性。在一些实施例中，所述组合物包括20pmole或更少的所述2类v型cas核酸内切酶。在一些实施例中，所述组合物包括1pmol或更少的所述2类v型cas核酸内切酶。

22、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的cd38基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述cd38基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：4466-4503和5686中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4428-4465和5685中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4466、4467、4468、4479、4484、4490、4492、4493、4495、4498中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4428、4429、4430、4436、4441、4446、4452、4454、4455、4460或4461中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

23、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的tigit基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述tigit基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：4521-4537中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4504-4520中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：4521、4527、4528、4535或4536中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4504、4510、4511、4518或4519中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

24、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的aavs1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述aavs1基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：4569-4599中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4538-4568中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857、6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4574、4577、4578、4579、4582、4584、4585、4586、4587、4589、4590、4591、4592、4593、4595、4596或4598中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4543、4546、4547、4548、4551、4553、4554、4555、4556、4558、4559、4560、4561、4562、4565或4567中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞、肝细胞或其前体。

25、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的b2m基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述b2m基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4676-4751中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4600-4675中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4676、4678-4687、4690、4692、4698-4707、4720-4723、4725-4726、4732-4733、4736-4737、4741或4750-4751中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：4600、4602-4611、4614、4616、4622-4631、4644-4647、4649-4650、4656-4657、4660-4661、4665或4674-4675中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

26、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的cd2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述cd2基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4837-4921中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4752-4836中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4837、4844、4845、4848、4857-4858、4883、4887、4892-4893、4904-4909、4914、4916或4918中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14e的靶向seq id no：4837、4844、4845、4848、4857-4858、4883、4887、4892-4893、4904-4909、4914、4916或4918中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

27、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的cd5基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述cd5基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4946-4969中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4922-4945中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：4946-4947、4949、4951、4957-4960、4963、4967或4969中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14f的靶向seq id no：4946-4947、4949、4951、4957-4960、4963、4967或4969中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

28、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的小鼠trac基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述小鼠trac基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5126-5195、5682或5684中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5056-5125、5681或5683中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5126-5130、5133-5143、5147-5150、5172-5173、5184-5189或5192-5194中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14g的靶向seq idno：5126-5130、5133-5143、5147-5150、5172-5173、5184-5189或5192-5194中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

29、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的小鼠trbc1或trbc2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述小鼠trbc1或trbc2基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5211-5225或5247-5267中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5196-5210或5226-5246中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5211、5213-5215、5217、5221、5223、5247、5249-5250、5252-5253、5258-5259或5264中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14h的靶向seq id no：5211、5213-5215、5217、5221、5223、5247、5249-5250、5252-5253、5258-5259或5264中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

30、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的人trbc1或trbc2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述人trbc1或trbc2基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5661-5679中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5642-5660中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq idno：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5661-5663、5672-5675或5678中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14i的靶向seq id no：5661-5663、5672-5675或5678中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

31、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的hprt基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述hprt基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：5562-5641中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5482-5561中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5562-5564或5568中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表14j的靶向seq id no：5562-5564或5568中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

32、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的apo-a1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述apo-a1基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seqid no：5861-5874中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5847-5860中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5861-5866或5868-5869中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导rna与来自表43a的靶向seq id no：5861-5866或5868-5869中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

33、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的angptl3基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述angptl3基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5953-6030中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5875-5952中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5955-5963、5968-5975、5979-5987、5989-5993、5997、5999、6003-6010、6014-6016、6024-6025或6027-6030中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。在一些实施例中所述工程化向导rna与来自表43b的靶向seq id no：5955-5963、5968-5975、5979-5987、5989-5993、5997、5999、6003-6010、6014-6016、6024-6025或6027-6030中的任一者的向导rna中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

34、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的人rosa26基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述人rosa26基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5013-5055中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：4970-5012中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

35、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的fas基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述fas基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq id no：5367-5465中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5268-5366中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

36、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的pd-1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述pd-1基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna被配置成与具有与seq idno：5474-5481中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者其中所述工程化向导rna包括与seq id no：5466-5473中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

37、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与seq id no：215中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列，其中与包括cas9酶的等效系统相比，当向人类受试者施用时，所述系统具有降低的免疫原性。在一些实施例中，所述cas9酶是spcas9酶。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述免疫原性是抗体免疫原性。

38、本公开的一方面提供了一种破坏细胞中的小鼠hao-1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述小鼠hao-1基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括来自表25的包括表25中所描述的核苷酸修饰的向导rnamh29-1_37、mh29-15_37、mh29-29_37的核苷酸；或者其中所述工程化向导rna包括seq id no：4184-4225中的任一者。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括来自表25的包括表25中所描述的核苷酸修饰的向导rna mh29-15_37或mh29-29_37的核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括破坏来自hao-1基因座的乙醇酸氧化酶的表达。

39、在一些方面，本公开提供了一种破坏细胞中的人trac基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述人trac基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括来自表28b的包括表28b中所描述的核苷酸修饰的mg29-1-trac-sgrna-35的核苷酸。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。

40、本公开的一方面提供了一种破坏细胞中的白蛋白基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：(a)2类v型cas核酸内切酶；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与所述白蛋白基因座的区杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括来自表29的包括表29中所描述的核苷酸修饰的malb298-37、malb2912-37、malb2918-37或malb298-34的核苷酸；或者其中所述工程化向导rna包括包含表46中所描述的核苷酸修饰的malb29-8-44、malb29-8-50、malb29-8-50b、malb29-8-51b、malb29-8-52b、malb29-8-53b或malb29-8-54b的核苷酸。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述向导rna包括与seq id no：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞、肝细胞、t细胞、造血干细胞或其前体。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括来自表29的包括表29中所描述的核苷酸修饰的malb298-37、malb2912-37、malb2918-37或malb298-34的核苷酸。

41、在一些方面，本公开提供了一种工程化向导rna，其包括：(a)dna靶向区段，所述dna靶向区段包括与靶dna分子中的靶序列互补的核苷酸序列；以及(b)蛋白质结合区段，所述蛋白质结合区段被配置成与2类v型cas核酸内切酶结合，并且其中所述向导rna包括表34中的seq id no：5695-5701中的任一者所描绘的核苷酸修饰模式。在一些实施例中，所述向导rna包括malb29-8-44、malb29-8-50、malb29-8-37或malb29-12-44。在一些实施例中，所述向导rna包括hh29-4_50、hh29-21_50、hh29-23_50、hh29-41_50、hh29-4_50b、hh29-21_50b、hh29-23_50b或hh29-41_50b、mh29-1-50、mh29-15-50、mh29-29-50、mh29-1-50b、mh29-15-50b或mh29-29-50b。在一些实施例中，所述dna靶向区段被配置成与hao-1基因或白蛋白基因杂交。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类v型cas核酸内切酶包括与seq id no：215具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。

42、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与seq id no：1-3470中的任一者或其变体或编码所述核酸内切酶的核苷酸序列具有至少75％序列同一性；以及(b)编码crispr阵列的多核苷酸序列，其中所述crispr阵列被配置成由所述核酸内切酶处理成工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列，其中所述间隔子序列被配置成与白蛋白基因杂交。在一些实施例中，所述多核苷酸序列包括与seq id no：5712具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括与seq id no：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。在一些实施例中，所述核酸内切酶包括与seq id no：215具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。

43、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与seq id no：470或其变体具有至少75％序列同一性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列。在一些实施例中，所述工程化向导rna包括与seq id no：6031具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶被配置成对包括seq id no：6032的5′pam序列具有选择性。

44、在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，其包括：(a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与seq id no：2824、2841或2896中的任一者或其变体具有至少至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性；以及(b)工程化向导rna，其中所述工程化向导rna被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导rna包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列，其中所述工程化向导rna包括与seq id no：6033、6034或6035中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述核酸内切酶与seq id no：2824具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导rna与seq id no：6033具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述核酸内切酶与seq id no：2841具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导rna与seq id no：6034具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述核酸内切酶与seq id no：2896具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导rna与seq id no：6035具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，所述核酸内切酶被配置成对包括seq id no：6037-6039中的任一者的5′pam序列具有选择性。

45、在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米颗粒，其包括：(a)本文所描述的核酸内切酶中的任何核酸内切酶；(b)本文所描述的工程化向导rna中的任何工程化向导rna：(c)阳离子脂质；(d)固醇；(e)中性脂质；以及(f)经peg修饰的脂质。在一些实施例中，所述阳离子脂质包括c12-200，所述固醇包括胆固醇，所述中性脂质包括dope，或所述经peg修饰的脂质包括dmg-peg2000。在一些实施例中，所述阳离子脂质包括图109中所描绘的阳离子脂质中的任何阳离子脂质。

46、对于本领域技术人员而言，通过以下具体实施方式，本公开的另外的方面和优点将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施例。如将认识到，本公开能够具有其它不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书本质上被视为是说明性的而非限制性的。

47、通过引用并入

48、本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请均通过相同的程度引用结合在此，如同特定且单独地指示每个单独的公开、专利或专利申请是通过引用并入的。