新型昆虫抑制蛋白的制作方法

本发明总体上涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型毒素蛋白，其对作物植物和种子的农业相关害虫，特别是鳞翅目物种的昆虫害虫表现出昆虫抑制活性。提供了植物、植物部分、种子、包括植物和微生物细胞的细胞、以及含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的载体。

背景技术：

1、提高重要农业植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、棉花、蔬菜、珍珠小米、木豆、花生、马铃薯、大麦、燕麦、果树等)的作物产量已变得越来越重要。除了为不断增长的人口提供食物、衣服和能源的农产品的需求不断增长之外，与气候相关的影响以及不断增长的人口将土地用于农业实践以外的压力预计将减少农业可用耕地的数量。这些因素导致了对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践缺乏重大改进的情况下。鉴于这些因素，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续改进是在数量日益有限的农业可用耕地上扩大作物生产的重要工具。

2、昆虫，特别是鳞翅目昆虫，是损害大田作物的主要原因，从而降低了受浸染地区的作物产量。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于黑粘虫(spodopteracosmioides)、小地老虎(agrotis ipsilon)、玉米穗虫(helicoverpa zea)、棉叶虫(alabama argillacea)、小菜蛾(plutella xylostella)、欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、cry1fa1抗性草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)、旧世界棉铃虫(helicoverpa armigera)、南方粘虫(spodoptera eridania)、大豆尺蠖(chrysodeixis includens)、斑点棉铃虫(earias vittella)、西南玉米螟(diatraea grandiosella)、向日葵尺蠖(rachiplusia nu)、烟夜蛾(heliothisvirescens)、斜纹夜蛾(spodoptera litura，也称为茶蚕(cluster caterpillar))、西方豆虫(striacosta albicosta)以及绒豆毛虫(anticarsia gemmatalis)。

3、历史上，农业中的害虫防治剂主要依靠合成化学杀虫剂的密集应用。除了新出现的抗性问题以及此类害虫防治剂不区分有益昆虫和其他生物并以有益昆虫和其他生物为目标的事实之外，对环境和人类健康的关注也刺激了专门用于防治造成作物损失的害虫的生物农药的研究和开发。这项研究工作导致了各种昆虫病原微生物物种(包括细菌)的逐步发现和使用。

4、当昆虫病原细菌，特别是属于芽孢杆菌(bacillus)属的细菌的潜力被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治范式发生了转变。苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)(bt)菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为已发现bt菌株对特定昆虫表现出高毒性。已知bt菌株产生δ-内毒素，其在孢子形成开始时和稳定生长期期间位于伴孢晶体包涵体内(例如，cry蛋白)，并且还已知其产生分泌性杀昆虫蛋白。易感昆虫摄入后，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥作用，破坏细胞膜，导致细胞破坏和死亡。还在bt以外的细菌物种中鉴定出编码杀昆虫蛋白的基因，包括其他芽孢杆菌和多种其他细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sphaericus)(“ls”先前也被称为球形芽孢杆菌(bacillussphaericus))、假单胞菌属(pseudomonas)物种、日本甲虫类芽孢杆菌(paenibacilluspopilliae)以及缓病类芽孢杆菌(paenibacillus lentimorbus)。此外，还从多种非细菌来源(包括蕨类植物、蜘蛛毒液)中鉴定出杀昆虫毒素，并且在害虫饮食中递送用于压制必需基因的dsrna已被确定为有效的害虫管理策略。

5、结晶和分泌的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且作为化学杀虫剂的替代品已获得全世界的认可。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业重要植物免受昆虫侵染，减少对化学农药应用的需要，以及提高产量。杀昆虫毒素蛋白用于通过以下方法防治作物植物的农业相关害虫：通过机械方法，诸如喷洒以将含有各种菌株的微生物制剂分散到植物表面，以及通过使用遗传转化技术来产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。

6、表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已在全球范围内得到应用。例如，在2016年，有2310万公顷种植了表达bt毒素的转基因作物，并且有7540万公顷种植了表达bt毒素并具有除草剂耐受性性状的转基因作物(isaaa.2016.global status ofcommercialized biotech/gm crops:2016.isaaa brief no.52.isaaa:ithaca,ny)。转基因防虫作物的全球使用和用于这些作物中的杀昆虫毒素蛋白的有限数量给能赋予对当前使用的杀昆虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因带来了选择压力。

7、目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式的杀昆虫毒素蛋白可用于管理昆虫对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的抗性的增加。具有改进的功效并对更广谱的易感昆虫物种表现出防治作用的新的蛋白毒素，将减少能够产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用两种或更多种转基因杀昆虫毒素蛋白，它们对同一昆虫害虫具有毒性，并表现出不同的作用模式，或者两种或更多种不同的毒性作用模式(例如，编码靶向待压制的必需基因的dsrna的转基因联合编码肽或蛋白毒素的转基因，两者对同一昆虫物种具有毒性)，降低了任何单一目标昆虫物种产生抗性的可能性。另外，当与本发明的蛋白一起使用时，使用自限制技术(诸如oxitec ltd提供的那些)将提高被赋予表达本发明蛋白的转基因作物的性状的持久性(zhou等人2018.combining the high-dose/refuge strategy and self-limiting transgenic insects in resistance management—a test in experimentalmesocosms.evol appl11(5):727–738；alphey等人2009.combining pest control andresistance management:synergy of engineered insects with bt crops.journal ofeconomic entomology,102:717-732)。

8、因此，发明人在本文中公开了一种来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白，以及相对于天然毒素表现出修饰的氨基酸序列的改进的工程化蛋白，和示例性重组蛋白，所述蛋白各自表现出针对目标鳞翅目物种的杀昆虫活性，特别是针对小地老虎(agrotis ipsilon)、玉米穗虫(helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(trichoplusia ni)、欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、南方粘虫(spodoptera eridania)、大豆尺蠖(chrysodeixis includens)、西南玉米螟(diatraea grandiosella)、绒豆毛虫(anticarsia gemmatalis)和西方豆虫(striacosta albicosta)以及半翅目物种牧草盲蝽(lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(euschistus heros)。

技术实现思路

1、本文公开了一种新型杀虫蛋白tic2199，已证实其表现出针对作物植物的一种或多种害虫的抑制活性。tic2199蛋白可以在制剂和植物原位(in planta)中单独使用或与其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合使用，从而针对目前在农业系统中使用的杀昆虫蛋白和杀虫化学品提供替代品。

2、在一个实施方案中，本技术公开了一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中所述杀虫蛋白包含seq idno:2、4、7、10、13、15或17的氨基酸序列；或者所述杀虫蛋白包含与seq id no:2、4、7、10、13、15或17的氨基酸序列具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或者所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有seq id no:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16或18的核苷酸序列的多核苷酸杂交。重组核酸分子可包含具有在植物中表达杀虫蛋白的功能的序列，并且当其在植物细胞中表达时产生杀虫有效量的杀虫蛋白或其杀虫片段。

3、在本技术的另一个实施方案中，重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。所考虑的细菌宿主细胞至少包括农杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)、芽孢杆菌属(bacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、泛菌属(pantoea)以及欧文氏菌属(erwinia)。在某些实施方案中，芽孢杆菌属物种是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，或者埃希氏菌属是大肠杆菌(escherichia coli)。所考虑的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所考虑的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物(例如，油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉花属(gossypium)物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜(pumpkin)、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。

4、在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫至少包括小地老虎(agrotis ipsilon)、玉米穗虫(helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(trichoplusia ni)、欧洲玉米螟(ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)、南方粘虫(spodoptera eridania)、大豆尺蠖(chrysodeixis includens)、西南玉米螟(diatraea grandiosella)、甘蔗螟(diatraea saccharalis)、绒豆毛虫(anticarsia gemmatalis)、西方豆虫(striacosta albicosta)和小玉米茎螟(elasmopalpus lignosellus)。

5、在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对半翅目昆虫的活性，所述半翅目昆虫至少包括牧草盲蝽(lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(euschistus heros)。

6、本技术还考虑了包含编码杀虫蛋白tic2199或其片段的重组核酸分子的细菌和植物及植物部分。重组分子(例如，构建体)可以包含异源启动子，其用于在细菌或植物细胞中表达可操作地连接的编码杀虫蛋白的多核苷酸区段。考虑了双子叶植物和单子叶植物两者。在另一个实施方案中，植物进一步选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物(例如，油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(即，棉花属物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、玉米(corn)(即玉米(maize))诸如甜玉米或饲料玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦。植物部分可以例如包括但不限于叶、块茎、根、茎、种子、胚、花、花序、棉铃、花粉、果实、动物饲料和生物质。还考虑了加工的植物部分，例如由含有编码本发明蛋白的核酸和/或含有杀虫有效量的所编码的毒素蛋白的植物叶、花、根、种子或块茎产生的木材或油、无活力的磨碎种子或分级种子、面粉或淀粉。

7、在某些实施方案中，公开了包含重组核酸分子和杀虫有效量的tic2199毒素蛋白的种子。

8、在另一个实施方案中，考虑了包含本技术中公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。昆虫抑制组合物还可包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，至少一种其他杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsrna分子和辅助蛋白组成的组。还考虑了昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：cry1a、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b、cry1c、cry1c变体、cry1d、cry1e、cry1f、cry1a/f嵌合体、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry2a、cry2ab、cry2ae、cry3、cry3a变体、cry3b、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry34、cry35、cry43a、cry43b、cry51aa1、et29、et33、et34、et35、et66、et70、tic400、tic407、tic417、tic431、tic800、tic807、tic834、tic853、tic900、tic901、tic1201、tic1415、tic2160、tic3131、tic836、tic860、tic867、tic869、tic1100、vip3a、vip3b、vip3ab、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100、axmi-115、axmi-113和axmi-005、axmi134、axmi-150、axmi-171、axmi-184、axmi-196、axmi-204、axmi-207、axmi-209、axmi-205、axmi-218、axmi-220、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z和axmi-225z、axmi-238、axmi-270、axmi-279、axmi-345、axmi-335、axmi-r1及其变体、ip3及其变体、dig-3、dig-5、dig-10、dig-657、dig-11蛋白、idp102aa及其同系物、idp110aa及其同系物、tic868、cry1da1_7、bcw003、tic1100、tic867、tic867_23、tic6757、tic7641、idp072aa、tic5290、tic3668、tic3669、tic3670、idp072aa和idp103及其同系物、pip-50和pip-65及其同系物、pip-83及其同系物、和cry1b.34；以及dsrna介导的基因压制实施方案，其包括靶向压制玉米根虫(diabrotica)物种基因dv snf7和dv ssj1的那些。

9、还考虑了包含可检测量的本技术中公开的重组核酸分子和毒素蛋白的商品产品。此类商品产品包括通过谷物处理机袋装的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米麦片等，以及对应的大豆、水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品产品，在适用的情况下，包括果汁、浓缩物、果酱、果冻、橘子酱和含有可检测量的本技术的此类多核苷酸和/或多肽的此类商品产品的其他可食用形式、完整或加工过的棉籽、棉油、皮棉、种子和加工用于饲料或食品的植物部分、纤维、纸张、生物质和燃料产品，诸如衍生自棉油的燃料或衍生自轧棉机废料的颗粒，完整或加工过的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、豆麸、豆浆、大豆奶酪、豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。

10、本技术还考虑了一种产生包含重组核酸分子和杀虫有效量的所编码的tic2199毒素蛋白的种子的方法。所述方法包括种植至少一种包含本技术公开的重组核酸分子的种子；从种子生长植物；以及从植物收获种子，其中收获的种子包含所提及的重组核酸分子和/或杀虫有效量的所编码的tic2199毒素蛋白。

11、在另一个例示性实施方案中，提供了对鳞翅目昆虫侵染具有抗性的植物，其中所述植物的细胞包含本文公开的重组核酸分子。

12、本技术还公开了用于防治鳞翅目物种害虫和防治植物、特别是作物植物的鳞翅目物种害虫侵染的方法。在一个实施方案中，所述方法包括首先使害虫与杀昆虫有效量的如seq id no:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白接触；或者使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述一种或多种杀虫蛋白包含与seq id no:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

13、本文还提供了一种检测tic2199毒素蛋白类别的重组核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组dna杂交，并且在此类杂交条件下不与不包含所述区段的其他同基因(isogenic)植物的基因组dna杂交，其中所述探针与seq id no:3、6、9、12、14、16或18或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与seq id no:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；将样品和探针置于严格杂交条件下；以及检测探针与样品dna的杂交。在一些实施方案中，检测tic2199毒素蛋白类别成员的存在的步骤可包括elisa或蛋白质印迹。

14、本文还提供了检测来自tic2199毒素蛋白类别的杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述方法包括使样品与tic2199毒素蛋白类别免疫反应性抗体或设计用于检测tic2199蛋白的重组蛋白接触，以及检测抗体与tic2199毒素蛋白类别蛋白的结合，从而确认样品中所述蛋白的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括elisa或蛋白质印迹。

15、本技术还考虑了一种用于防治田地中的鳞翅目害虫物种或害虫侵染的方法，其中所述方法包括生长表达杀昆虫有效量的如seq id no:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白的作物植物；或生长表达杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白的作物植物，所述一种或多种杀虫蛋白包含与seq id no:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及将一种或多种各自携带自限性基因的转基因鳞翅目害虫物种释放到含有编码本发明毒素蛋白的基因的作物的田地中，以用于预防或延迟所述一种或多种鳞翅目害虫物种对毒素蛋白的抗性发生。在一个实施方案中，作物植物可以是单子叶或双子叶。在另一个实施方案中，单子叶作物植物可以是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或小米。在又另一个实施方案中，双子叶作物植物可以是大豆、棉花或油菜。

16、序列简述

17、seq id no:1是编码从苏云金芽孢杆菌物种eg8639获得的tic2199杀虫蛋白的核酸序列。

18、seq id no:2是由seq id no:1所示的序列编码的tic2199杀虫蛋白的氨基酸序列。

19、seq id no:3是编码tic2199并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

20、seq id no:4是tic2199变体tic2199_3的氨基酸序列，其中包含分泌肽的n末端44个氨基酸已被去除，并且c末端64个氨基酸也被去除。

21、seq id no:5是编码seq id no:4的tic2199_3变体的dna序列。

22、seq id no:6是编码seq id no:4的tic2199_3变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

23、seq id no:7是tic2199变体tic2199_1的氨基酸序列，其中包含分泌肽的n末端44个氨基酸已被去除。

24、seq id no:8是编码seq id no:7的tic2199_1变体的dna序列。

25、seq id no:9是编码seq id no:7的tic2199_1变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

26、seq id no:10是tic2199变体tic2199_2的氨基酸序列，其中c末端64个氨基酸也被去除。

27、seq id no:11是编码seq id no:10的tic2199_2变体的dna序列。

28、seq id no:12是编码seq id no:10的tic2199_2变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

29、seq id no:13是变体tic2199_1变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

30、seq id no:14是编码tic2199_1变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。

31、seq id no:15是变体tic2199_2变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

32、seq id no:16是编码tic2199_2变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。

33、seq id no:17是变体tic2199_3变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

34、seq id no:18是编码tic2199_3变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。