一种黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用

本发明涉及一种甜叶菊来源的黄酮糖基转移酶(udp-glycosyltransferases,ugt)及其编码基因与应用，属于基因工程和酶工程。

背景技术：

1、黄酮类化合物是植物体内含量和种类丰富的一类次级代谢物，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、改善糖和脂代谢、保护心脑血管系统等多种药理活性。糖基化是黄酮类化合物最常见的修饰方法之一，进一步提高了黄酮类化合物的丰富程度，为药物筛选提供了巨大物质基础。糖基化也可以改变黄酮类分子的亲疏水性、化学稳定性、亚细胞定位等特征，从而调节黄酮类分子在细胞及植物体内的转运和功能，参与植物的胁迫应答机制。在植物体内过表达某些黄酮糖基转移酶能够消除黄酮生物合成途径中的产物抑制，激活黄酮生物合成途径，累积更多次级代谢物，提高植物的胁迫响应能力。

2、黄酮糖苷类天然产物多是从植物中分离得到，但是复杂的植物提取工艺流程和高昂的分离纯化成本使得大规模制备受到限制。化学合成糖苷涉及冗长的基团保护和去保护步骤以便实现区域选择性和立体选择性糖基化，使合成产率较低。植物体内的黄酮类化合物的糖基化是由糖基转移酶(glycosyltransferase，gt，ec 2.4.x.y)催化的，它们将糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键，一般具有较高的区域特异性。目前黄酮醇7-o-葡萄糖苷的生物合成研究鲜有报道，且黄酮7-o-葡萄糖苷(芹菜素-7-o-葡萄糖苷和木犀草素-7-o-葡萄糖苷)的产量相对较低。植物中参与黄酮糖基化的酶为gt1家族的糖基转移酶，在模式生物如拟南芥、水稻中研究较多，但是在甜叶菊中的研究相对稀缺。并且，大多数已知的黄酮糖基转移酶只能糖基化黄酮类物质的单一位点，部分可以糖基化黄酮的3位或5位羟基，目前尚未发现具有同时实现3位、5位、7位糖基化的糖基转移酶。

3、甜叶菊中含有多种黄酮糖苷，如芦丁、山奈酚葡糖苷、山奈酚鼠李糖苷、槲皮素3/7-o-葡糖苷，槲皮素3-o-阿拉伯糖苷等。这些黄酮糖苷在甜叶菊植物免疫防御过程中发挥重要作用。因此，筛选甜叶菊中具有3/5/7-o糖基化功能的ugt，阐明它的催化活性，并将其用于黄酮糖苷的合成生物学研究，或者甜叶菊品质改良具有重要的意义。

4、甜叶菊中多种黄酮糖苷的存在表明甜叶菊中有多种参与黄酮糖基化的糖基转移酶。四川农业大学刘琼等人对甜叶菊中黄酮糖基转移酶进行了筛选和研究，发现srugt-741对异槲皮苷有催化活性，srugt-720和srugt-752对山奈酚有催化活性，srugt-634对芹菜素有催化活性。目前研究显示参与植物糖基转移酶具有灵活的底物容纳性，能够糖基化多种底物，而上述研究鉴定到的糖基转移酶只能催化一种底物，从其提供液相结果分析，底物峰远高于产物峰，酶催化活性较差。并且这些酶的糖基化产物单一，且糖基化位点未知。因此，甜叶菊中具有高活性的或者具有多位点糖基化的黄酮糖基转移酶仍有待进一步挖掘和功能验证。

5、本专利提供了一个新的甜叶菊中黄酮糖基转移酶，该糖基转移酶具有作用底物广谱，高活性，能实现黄酮3位、5位、7位羟基糖基化的特点，能够糖基化7-羟基黄酮、芹菜素、槲皮素、山奈酚、木犀草素等黄酮或黄酮醇类物质，并且糖基化产物多样，对于体外制备槲皮素和山奈酚不同位置糖基化产物有潜在应用价值。黄酮类物质属于苯丙烷代谢通路产物，而苯丙烷代谢通路与植物抗病相关，黄酮类物质的糖基化促进苯丙烷通路正向进行，有利于提高植物抗病能力。因此该酶在甜叶菊品质改良方面也有潜在应用价值。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种甜叶菊黄酮糖基转移酶基因及其编码的蛋白质，本发明的第二个目的在于提供上述黄酮糖基转移酶的制备方法，本发明的第三个目的是提供甜叶菊黄酮糖基转移酶在黄酮糖苷体外合成中的应用。

2、为实现上述技术目的，本发明采用技术方案如下：

3、本发明第一方面，提供一种黄酮糖基转移酶，其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

4、1)具有seq id no.1所示的氨基酸序列；

5、maefakrlvqhhhisatiivpttgappktqisvleslpenihhlflppvsvdglpedtrperiit

6、fimeaslsslkdalsslksktklvalafdmfghvsmkvsqelnllnflffpmslmaltftfi

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12、2)具有如seq id no.1从氨基端开始第1-424位氨基酸残基序列；

13、3)对seq id no.1所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代和/或缺失和/或添加而形成的具有黄酮糖基转移酶活性的氨基酸序列；

14、4)与seq id no.1具有至少80％同一性的氨基酸序列。

15、本发明第二方面提供了一种黄酮糖基转移酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

16、1)具有seq id no.2所示的脱氧核糖核酸序列；

17、atggccgagtttgctaagcgactcgtccaacaccaccatatctccgccactatcatcgtt

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39、2)编码seq id no.1氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；

40、3)对seq id no.2的脱氧核糖核酸序列进行一个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码具有黄酮糖基转移酶活性的核苷酸序列；

41、4)与seq id no.2限定的脱氧核糖核酸序列的同源性达到80％及以上，且能编码黄酮糖基转移酶的脱氧核糖核酸序列。

42、本发明第三方面提供了含有所述黄酮糖基转移酶基因的重组表达质粒。

43、本发明第四方面提供了含有所述黄酮糖基转移酶基因的重组基因工程菌。

44、本发明第五方面提供了黄酮糖基转移酶的制备方法，将前述黄酮糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的黄酮糖基转移酶。

45、上述技术方案中，进一步地，所述的重组表达载体包括大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

46、所述宿主细胞包括大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种。

47、本发明第六方面提供了前述黄酮糖基转移酶在催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类和二羟基查尔酮类化合物糖基化的应用；在制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、二氢黄酮糖苷类和二羟基查尔酮糖苷类化合物的应用；在制备黄酮双糖苷化合物的应用。

48、上述技术方案中，进一步地，所述黄酮醇糖苷类化合物包括槲皮素-3-o-葡萄糖苷、槲皮素-5-o-葡萄糖苷、槲皮素-7-o-葡萄糖苷、槲皮素-3,7-o-双葡萄糖苷、山奈酚-3-o-葡萄糖苷、山奈酚-5-o-葡萄糖苷和山奈酚-7-o-葡萄糖苷；所述黄酮糖苷类化合物包括芹菜素-5-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-葡萄糖苷和木犀草素-5-o-葡萄糖苷、木犀草素-7-o-葡萄糖苷；所述黄酮双糖苷类化合物包括槲皮素-3,7-o-双葡萄糖苷。

49、上述技术方案中，进一步地，所述应用的底物糖基化位点包括黄酮3位和/或5位和/或7位羟基。

50、本发明第七方面提供了前述黄酮糖基转移酶基因在甜叶菊遗传育种中的应用。

51、与现有技术相比，本发明的有益效果：

52、本发明提供的srugt72b1是首次发现的在甜叶菊(stevia rebaudiana)中能够催化黄酮类化合物糖基化的一个3-、5-、7-o糖基转移酶，本发明利用pcr技术从cdna获得了基因的全长序列。通过构建pet21a蛋白表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)后诱导、纯化得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明srugt72b1具有广谱的催化活性，能够催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类以及二羟基查尔酮类化合物糖苷化。其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚、槲皮素-3-o-葡萄糖苷)，黄酮(芹菜素，木犀草素)等化合物的催化效率较高，产物种类丰富，可用于生物合成这些化合物的3-、5-、7-o糖基化产物，并且能够糖基化槲皮素-3-o-葡萄糖苷的7位羟基、槲皮素-5-o-葡萄糖苷的3位羟基、槲皮素-7-o-葡萄糖苷的3位羟基，得到双糖基化产物，因此具有较高的经济价值和广阔的应用前景。