一种毛囊修复蛋白组合物及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种毛囊修复蛋白组合物及其制备方法和其应用。

背景技术：

1、头发茂密是身体健康和毛发健康的重要标志。毛囊健康是毛发健康的基础，保持毛囊健康的关键在于激活头皮系统内的毛囊基质细胞。毛囊经历着生长期、退行期、休止期的周期性生长循环。毛囊的周期性变化与毛囊基质细胞的周期性分裂、增殖、分化等密切相关。高活性的毛囊基质细胞持续释放大量的毛囊基质细胞生长因子，促进毛囊细胞进入自我修复、成长、分裂和头发生长的良性循环。

2、现代人受生活忙碌、工作压力、环境污染等因素的影响，出现头发易断裂、提早老化、脱发严重、毛发再生障碍等问题，严重影响个人形象，甚至造成心理疾病。

3、毛发疾病包括患者出现少毛、多毛、毛发分布异常、毛发密度异常、毛发直径异常、毛发色素异常、毛干异常等生理或病理表现。脱发包括生理性脱发和病理性脱发。生理性脱发包括自然脱发、季节性脱发、婴儿脱发、老年性脱发和产后脱发等。病理性脱发包括非瘢痕性脱发和瘢痕性脱发。非瘢痕性脱发包括雄激素性秃发(占比约95％)、斑秃(占比约4％)、梅毒性脱发、拔毛癖、休止期脱发、生长期脱发、牵拉性脱发、机械性脱发、秃发性毛囊炎、脓肿性穿凿性毛囊炎、先天性少毛症等。祛除非瘢痕性脱发的致病因素后，则毛发重新长出。瘢痕性脱发会永久性地破坏毛囊，导致永久性脱发，病因包括外伤、感染、炎症性皮肤病(如盘型红斑狼疮、毛发扁平苔藓等)、头皮扁平苔癣、头皮盘状红斑狼疮、放射性脱发、女性纤维性脱发、头皮烧烫伤等。

4、病理性脱发患者出现头发异常、过度脱落而导致发量明显减少。常见的脱发病因包括雄激素过多、遗传、压力过大、怀孕、疾病、药物、损伤等。自身免疫病、甲状腺疾病、红斑狼疮、糖尿病、铁缺乏、进食障碍和贫血等疾病，导致体内激素水平变化而加重脱发。抗肿瘤药物、血液稀释剂、降压药物、避孕药物、烧伤、各种损伤、x射线辐射等导致暂时性脱发。

5、脂溢性脱发(雄激素性脱发，aga)以头皮油脂过量溢出、头发逐渐变细、变软、变少等为主要表现的毛发疾病，可伴有头皮瘙痒、头皮屑和瘙痒等，是一种具有遗传因素参与的且依赖雄激素作用导致的进行性毛囊病变。我国aga患者总数超过1亿，男性患病率(20.2％)多于女性(5.1％)。

6、细胞是生命活动的基本单位和机体健康的基础。当机体的氧化还原平衡遭到破坏时，会引起氧化还原信号和控制的中断，引发氧化应激损伤而产生多种疾病。已有研究表明，毛囊干细胞的数量及活性、毛囊的再生能力等因素与头发脱落直接关联。毛囊干细胞的数量及活性降低导致毛囊细胞分化能力减弱而影响毛发的再生循环，导致毛囊闭合而形成永久性脱发。治疗脱发的主要方法包括洗疗护理、药物治疗、激光生发、植发等。洗疗护理主要以生发液或生发剂等外用产品刺激头皮并促进头皮血液循环，促进头部供血、头部营养和头发生长，但存在生发及防脱发不佳，且对受损毛囊、休眠毛囊无效等缺陷。药物治疗包括口服药物(如非那雄胺、螺内酯、vb2、vb6、丹参酮胶囊、复方甘草酸苷片、白芍总苷胶囊等)和外用药物(如米诺地尔溶液、哈西奈德溶液、二硫化硒洗剂等)，但存在治疗脱发效果不佳、副作用较大、药物依赖性等缺陷。激光生发利用波长为670nm的低能量激光照射，增强细胞活性、加速血液微循环、增加头部供血及营养等，促进头发汲取营养成分，提高毛母细胞及毛囊干细胞活力，加速蛋白质的合成、激活毛囊等功效，但存在生发缓慢且价格昂贵等缺陷。植发需要手术选取患者后枕部及两颞部毛囊作为发源，将采集的毛囊分离成单株毛囊或多株毛囊后，再通过精细的显微外科手术把单株毛囊或多株毛囊移植到需要移植的脱发部位，使得新移植的单株毛囊或多株毛囊在新的植发部位存活和生长，进而修补局部毛发的分布及分布密度。虽然植发技术可解决毛囊完全闭合问题，但存在受可移植部位及毛囊资源有限的限制，且植发手术比较痛苦、存在感染风险、新移植毛囊存活率没有保障、无法解决受损毛囊修复问题、移植手术部位留下疤痕而影响美观、价格昂贵等缺陷。为此，临床急需生发效果和防脱发效果更佳、疗效确切、安全有效的生发组合物。

7、细胞及微生物受到外界刺激及外源应激物(包括冷、热、酸、碱、电流、辐射、化学物质等)应激诱导时会因应激反应而诱导细胞及微生物产生应激蛋白。文献1(newlimonophyllines a-cfrom the stem of atalantia monophylla and cytotoxicityagainst cholangiocarcinoma and hepg2 cell lines，arch.pharm.res.(2018)41:431–437)公开了从芸香科植物(atalantia monophylla)提取制得的化合物1-16具有抑制肿瘤细胞生长等活性。

8、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。但mscs产品需在其生产、储运和应用等环节采用冷藏方式，且其细胞活力保持≤12h，而限制其治疗应用。为此，需要开发安全有效的毛囊修复药物以满足临床需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种毛囊修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：

2、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液；

3、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

4、本发明的优选技术方案中，所述蛋白提取物的制备包括如下步骤：

5、s-1:将密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml的间充质传代细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-60min后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合，

6、

7、

8、s-2:将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-5.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃条件下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

9、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

10、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

11、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

12、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞密度为6.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

13、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞在培养基中培养15-50min，优选为20-40min。

14、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,洗涤细胞次数为2-5次，优选为3-4次。

15、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

16、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

17、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

18、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

19、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

20、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一种酶解后再分离纯化。

21、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

22、本发明的优选技术方案中，所述毛囊修复蛋白组合物的分子量为20kda-300kda，优选为50kda-200kda。

23、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

24、本发明的优选技术方案中，在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，制得细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

25、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述细胞蛋白提取物或蛋白组合物冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

26、本发明的优选技术方案中，在在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

27、本发明的优选技术方案，所述细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

28、本发明的优选技术方案，所述毛囊修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

29、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用等渗溶液复溶后，采用涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用，其中，所述的等渗溶液选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合。

30、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养为本领域的培养方法。

31、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

32、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

33、a:将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

34、b:振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

35、本发明的目的在于提供一种具有毛囊修复功效的细胞蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

36、s-1:将密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml的间充质传代细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养20-40min后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合；

37、s-2:将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-5.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃条件下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

38、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

39、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

40、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

41、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞密度为6.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

42、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞在培养基中培养15-50min，优选为20-40min。

43、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,洗涤细胞次数为2-5次，优选为3-4次。

44、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

45、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

46、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

47、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

48、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

49、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

50、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一种酶解后再分离纯化。

51、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养为本领域的培养方法。

52、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

53、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

54、a:将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

55、b:振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

56、本发明的目的在于提供一种毛囊修复蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：

57、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液；

58、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

59、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

60、本发明的优选技术方案中，所述毛囊修复蛋白组合物的分子量为20kda-300kda，优选为50kda-200kda。

61、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)制得的蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

62、本发明的优选技术方案中，在步骤(2)制得的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，即得，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

63、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

64、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)制得的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

65、本发明的优选技术方案，所述蛋白组合物冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

66、本发明的优选技术方案，所述毛囊修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

67、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用等渗溶液复溶后，采用涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用，其中，所述的等渗溶液选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合。

68、本发明的另一目的在于提供一种毛囊修复组合物，所述组合物由本发明的具有毛囊修复功效的细胞蛋白提取物或毛囊修复蛋白组合物的任一种或其组合和药学上可接受的载体组成。

69、本发明的药学上可接受载体的用量或其种类根据组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂的溶出及生物利用度等因素而定。

70、本发明的组合物可为本领域的剂型，并可采用本领域的制剂技术制备得到。

71、本发明的优选技术方案中，所述组合物选自冻干剂、凝胶剂、鼻喷剂、膏剂、霜剂、乳剂、液体敷料、注射剂、栓剂的任一种。

72、本发明的优选技术方案中，所述组合物的给药方式选自涂抹、滚针、微针、按摩的任一种或其组合。

73、本发明的另一目的在于提供本发明所述具有毛囊修复功效的细胞蛋白提取物、毛囊修复蛋白组合物或其组合物用于制备细胞修复、毛囊修复的制品中的应用。

74、本发明的优选技术方案，所述制品选自生发制品、防治毛发疾病制品、防治病理性脱发制品、延缓生理性脱发制品、改善头皮环境制品中的任一种的应用，其中，所述毛发疾病选自少毛、多毛、分布异常、头发密度异常、头发直径异常、头发色素异常、毛干的任一种或其组合，所述病理性脱发选自雄激素性秃发、斑秃、梅毒性脱发、拔毛癖、机械性脱发、秃发性毛囊炎、脓肿性穿凿性毛囊炎、先天性少毛症的任一种、头皮扁平苔癣、毛发扁平苔癣、头皮盘状红斑狼疮、放射性脱发、女性纤维性脱发、头皮烧烫伤的任一种，所述生理性脱发选自自然脱发、季节性脱发、婴儿脱发、老年性脱发、产后脱发的任一种。

75、本发明的另一目的在于提供本发明的生发制品用于治疗生发及防脱发的给药方案，受试者接受每间隔两周至四周给药一次、三次为一疗程的治疗，采用微针、滚针的任一种刺破脱发部位后局部涂抹给药，按摩至全部吸收。

76、本发明的优选技术方案中，治疗部位在治疗前先给予局部麻醉。

77、本发明的另一目的在于提供化合物1-16用于应激诱导干细胞产生具有修复功效的功能蛋白的应用。

78、本发明的优选技术方案中，所述修复为细胞修复、毛囊修复、关节修复、神经修复中的任一种。

79、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

80、除非另有说明，本发明间充质干细胞mscs鉴定参照《standards for the cultureand quality control of umbilical cord mesenchymal stromal cells forneurorestorative clinical application》。

81、与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：

82、1、本发明科学筛选含有应激物的培养基应激诱导间充质干细胞产生具有细胞修复、毛囊修复功效的功能蛋白，且含有多种具有调控细胞增殖与分化、细胞修复及细胞营养等功能的生长因子和蛋白质，所得的细胞蛋白提取物、细胞蛋白组合物或其组合物具有修复细胞、受损毛囊细胞的作用，采用微针、滚针的任一种刺破脱发部位后局部透皮导入本发明的毛囊修复蛋白组合物，在头皮表面形成有效的给药通道，直达毛囊根部，高效修复受损毛囊并显著提升毛囊活性，并具有纯度高、稳定性好、安全有效、有效解决活细胞需要冷藏且其活性受细胞活力时间限制等优点，促进受损毛囊修复及胶原蛋白生成，促进毛发再生，显著改善头发瘙痒、油脂过量溢出、头皮屑等伴随症状及患者用药的依从性，为临床提供一种疗效确切、高吸收率、无头皮刺激性、安全有效、简便快捷的治疗方法。

83、2、本发明的制备方法具有操作简便，绿色环保，成本更优，适用于工业化生产等优点。