一种荧光探针及其应用

本发明属于探针，具体涉及一种荧光探针及其应用。

背景技术：

1、癌症干细胞(csc)是具有自我更新能力的干细胞，来源于癌细胞，可实现肿瘤异质性和转移，是放疗和化疗失败的原因之一。因此，精准分辨出癌症干细胞并消除它，是一个极为迫切的靶向治疗癌症干细胞新方法，为改善整个癌症治疗体系提供了新的可能性。对csc进行研究的前提和基础是在体外从子代肿瘤细胞中分离和培养相应类型的csc。目前常用的csc分离的方法主要是分选法和悬浮培养法，其中，悬浮培养法能提供给csc类似于肿瘤干细胞“龛”的生长环境，非肿瘤干细胞在这样的环境中则不能生存。目前，研究人员已对乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、肝癌等众多肿瘤细胞建立了相应的csc悬浮培养体系，得到的微球体(microspheres)经验证均具有肿瘤干细胞特性。因此，用悬浮培养基对癌细胞进行悬浮培养获得微球体是目前在体外研究癌症干细胞的一种有效且常用的方法，微球体是研究csc理想的细胞模型。

2、然而，目前微球体的识别方法有：rna测序、流式细胞仪检测和免疫组化技术，不仅步骤复杂，成本较高且需要一系列数据分析结果，严重阻碍了与微球体相关的细胞学研究。如果能找到应用于微球体荧光成像的荧光探针，能准确的识别微球体，将极大的方便对微球体的研究。

3、四苯基乙烯衍生物是一类在固态或聚集态下由于构象旋转受限制而荧光大幅增强的化合物，作为一种聚集诱导发光材料，受到了广泛的关注。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种荧光探针及其应用，结构为tpe-cor，其中，r代表oh或多肽，分别为tpe-cooh和tpe-peptide荧光探针；该荧光探针能够快速有效地识别癌症微球体细胞，并进行可视化荧光成像，具有特异性且选择性较高，为改善整个癌症治疗体系提供了新的可能性。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种荧光探针及其应用，其特征在于，所述荧光探针结构为：

3、

4、其中，r代表oh，或多肽。

5、当r代表oh时，该荧光探针的化学名称为四苯乙烯羧酸(tpe-cooh)，分子式：c28h22o3；结构为：

6、

7、本发明还提供了tpe-cooh荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

8、步骤一、在0℃的条件下，将二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、锌粉和四氢呋喃加入三口烧瓶中，随后再缓慢加入四氯化钛，在氮气的保护下，回流过夜；

9、步骤二、反应结束后，将混合物冷却至室温，减压蒸馏去除溶剂，固体用二氯甲烷溶解，加入浓度为1mmol/l的盐酸溶液进行萃取，有机相用无水mgso4干燥，静置过夜；

10、步骤三、硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体，记为tpe-cooh中间体1；在圆底烧瓶中加入中间体1、溴乙酸叔丁酯、k2co3、和乙腈，回流过夜；

11、步骤四、反应结束后将该混合物过滤分离，用硅胶柱层析再次纯化，析出tpe-cooh中间体2；将中间体2加入二氯甲烷和三氟乙酸混合溶剂中搅拌3h；反应结束后将该混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取3次，析出的白色固体即为tpe-cooh。

12、当r代表多肽时，所述多肽为七肽，其氨基酸序列为asn-thr-gly-ser-pro-tyr-glu，该荧光探针的化学名称为四苯乙烯多肽(tpe-peptide)，分子式：c68h79n9o18s2，结构为：

13、

14、本发明还提供了tpe-peptide荧光探针的制备方法，该方法为：

15、在室温下将tpe-cooh溶解在无水二氯甲烷中，向该溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和n,n-二异丙基乙胺(diea)，并在室温下连续搅拌2min，形成黄色溶液；然后将溶于二氯甲烷的多肽滴加到该溶液中，在室温下持续搅拌48h；将反应产物冷冻干燥，用高效液相色谱分离后，得到tpe-peptide。

16、本发明还提供了荧光探针的应用，所述荧光探针应用于特异性识别癌症微球体细胞，并形成可视化荧光成像。

17、所述荧光探针应用于特异性识别癌症微球体细胞，并形成可视化荧光成像的检测方法为：

18、s1、在37℃、5％co2的培养箱中，将癌症细胞用含1％抗生素和10％胎牛血清的dmem培养基进行培养，当细胞长至汇合度为80％～90％时，弃旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗三遍，加入1ml0.25％胰酶消化，完成后加入2ml含血清的完全培养基终止消化；将细胞转移至5ml离心管中，1000rpm离心5min，之后弃上清，用2ml微球体专用培养基重悬，然后进行悬浮培养，培养箱条件为37℃、5％co2，培养5d～8d，用血细胞计数板计数癌症细胞为5×105个/ml，得到癌症微球体细胞悬液；

19、所述微球体专用培养基为：dmem-f12培养基48.2ml、b27添加剂1ml、肝素0.5ml、浓度为100μg/ml的人表皮生长因子(hegf)0.05ml、浓度为50μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)0.25ml，总体积50ml；

20、s2、取s1得到的癌症微球体细胞悬液2ml于离心管中，离心5min，弃废液，然后用pbs重悬，洗3遍；配制荧光探针储备液，将该储备液与微球体在37℃、5％co2的培养箱中孵育1h后，用pbs重悬，洗3遍，摇床摇5min；然后室温下加入500μl4％多聚甲醛固定液，固定1h后，用pbs洗3遍，摇床摇5min；滴加6μl含甘油的抗荧光衰减封片剂，在激光共聚焦显微镜下观察，获得蓝色荧光。

21、优选地，s1所述癌症细胞包括肝癌细胞hepg2、肝癌细胞qgy-7701、肝癌细胞smmc-7721、肺癌细胞a549或宫颈癌细胞hela。

22、优选地，s2所述荧光探针储备液的配制方法为：用细胞专用二甲基亚砜溶液将荧光探针配制成1×10-3mol/l的母液，再用纯dmem培养基稀释至浓度为5μmol/l。

23、优选地，s2所述荧光激发的波长为405nm。

24、本发明与现有技术相比具有以下优点：

25、1、本发明的荧光探针结构简单、合成步骤简洁易操作，能对微球体细胞进行可视化荧光成像，具有特异性且选择性较高。

26、2、本发明将癌细胞悬浮培养得到的微球体作为csc细胞模型，用tpe-cooh和tpe-peptide荧光探针对该细胞模型进行成像，为今后癌症的早期诊断和靶向治疗的研究提供实验基础；两种探针对于正常的细胞和癌细胞不识别，对微球体细胞能特异性识别，其荧光成像的浓度为5μmol/l，能够满足细胞毒性检测要求。

27、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

技术特征：

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针结构为：

2.根据权利要求1所述的一种荧光探针，其特征在于，当r代表oh时，该荧光探针的化学名称为四苯乙烯羧酸，结构为：

3.根据权利要求1所述的一种荧光探针，其特征在于，当r代表多肽时，所述多肽为七肽，其氨基酸序列为asn-thr-gly-ser-pro-tyr-glu，该荧光探针的化学名称为四苯乙烯多肽，结构为：

4.一种如权利要求1-3任一权利要求所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于特异性识别癌症微球体细胞，并形成可视化荧光成像。

5.根据权利要求4所述的荧光探针的应用，其特征在于，荧光探针应用于特异性识别癌症微球体细胞，并形成可视化荧光成像的检测方法为：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，s1所述癌症细胞包括肝癌细胞hepg2、肝癌细胞qgy-7701、肝癌细胞smmc-7721、肺癌细胞a549或宫颈癌细胞hela。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，s2所述荧光探针储备液的配制方法为：用二甲基亚砜溶液将荧光探针配制成1×10-3mol/l的母液，再用dmem培养基稀释至浓度为5μmol/l。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，s2所述荧光激发的波长为405nm。

技术总结
本发明提供了一种荧光探针及其应用，结构为TPE‑COR，其中，R代表OH或多肽，分别为四苯乙烯羧酸(TPE‑COOH)和四苯乙烯多肽(TPE‑Peptide)荧光探针，应用于特异性识别癌症微球体细胞。所述癌症微球体细胞是通过悬浮培养法为癌细胞提供一个特定的生长环境而形成的3D球状细胞，是目前研究癌症干细胞的理想体外模型。本发明还提供了荧光探针的制备方法，其结构简单，合成步骤简洁易操作。本发明的荧光探针TPE‑COOH和TPE‑Peptide能够快速有效地识别癌症微球体细胞，并进行可视化荧光成像，具有特异性且选择性较高，为改善整个癌症治疗体系提供了新的可能性。

技术研发人员：张奇龙,罗芳,徐红,沈凌屹,黄亚励
受保护的技术使用者：贵州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12