一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体制备，尤其涉及一种抗hba1c的纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、1993年布鲁塞尔自由大学的hamers-casterman等首先报道了骆驼血液中除了传统的igg抗体外还存在另一种类型的抗体，与传统的哺乳动物抗体igg分子结构不同，这种抗体既缺失传统抗体的轻链，也缺少重链恒定区的ch1区域，被称为重链抗体(heavy chainantibody，hcab)。其抗原结合部位，即可变区，也被称为vhh区，采用分子生物学技术直接克隆并重组表达vhh，可以获得上述可变区片段，被称为单域抗体，通常仅有110-130个氨基酸组成，分子量仅有12-15kda，因此也被称为纳米抗体。纳米抗体远远小于传统完整抗体(150–160kda)及其fab片段(约50kda)，但却能具备与传统抗体相似或更高的特异性抗原亲和力。单域抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和易于重组表达制备的特点使得其在被发现后备受关注，经过20多年的研究，在免疫研究、诊断检测、医学和生物学成像、治疗性抗体发展等领域的应用均取得了积极进展。

2、糖化血红蛋白(hba1c)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物，与血液中葡萄糖的浓度成正比，可反映120天前的血糖水平。且糖化血红蛋白不受抽血时间、是否空腹、是否使用胰岛素以及其他能使血糖水平短暂波动的因素影响。糖化血红蛋白由hba1a、hba1b、hba1c组成，其中hba1c占约70％，且结构较为稳定，临床上常用作糖尿病控制的监测指标，其浓度用占成人血红蛋白的百分比表示。糖化血红蛋白检测特异性强、重复性好、灵敏度高，对糖尿病的筛查和监控有重要意义。

3、随着人民生活水平的不断提高和人口的老龄化进程加快，糖尿病患者总数也在急剧膨胀，各个国家糖尿病患者和潜在的糖尿病患者也在迅速增多，以目前形式发展，到2030年全球糖尿病患者人口总数将达3.5亿人。但目前测定hba1c的主流方法是直接胶乳免疫比浊法，需要相对应的抗体，在灵敏度和操作稳定性上均存在一定的缺陷。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种力纳米抗体的筛选方法，从而快速的获得高亲和力纳米抗体

2、为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：提供一种抗hba1c的纳米抗体制备方法，包括以下步骤：

3、s1、构建纳米抗体噬菌体展示文库；

4、s2、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行hba1c纳米抗体的筛选以及原核表达验证；

5、其中，所述步骤s1中，包括如下步骤：

6、a1、制备高活性免疫抗原并免疫目的动物；

7、a2、分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取rna，经过反转录获得cdna；

8、a3、以所述cdna为模板进行两轮pcr扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体基因文库以及纳米抗体展示文库。

9、优选地，所述高活性免疫抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因合成后，如seq id no.2所示，所述高活性免疫抗原经过合成并构建到哺乳动物表达载体上，通过pei瞬时转染至293f细胞中表达，再经过his标签纯化抗原。

10、优选地，所述步骤a1中，将高活性免疫抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照0.5mg/次的剂量对所述免疫动物进行背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫4次，免疫间隔为2周，所述目的动物为羊驼。

11、优选地，所述步骤a3中，以所述cdna为模板进行两轮pcr扩增获得纳米抗体片段的具体方法如下：取免疫动物外周血10ml，分离pbmc并提取rna，经过反转录获得cdna，所用引物为随机引物，如seq id no.3所示。并以获得的cdna为模板进行pcr扩增，以获得纳米抗体基因文库，两轮pcr所用引物分别为seq id no.4与seq id no.5，seq id no.6与seq idno.7。

12、优选地，所述步骤a3中，所述展示载体为pad1-10b噬菌体展示载体。

13、优选地，所述步骤a3中，将所述目的动物的纳米抗体片段与所述展示载体连接，而后转化感受态细胞ss320，制备纳米抗体基因文库，再采用辅助噬菌体m13k07感染所述纳米抗体文库制得纳米抗体展示文库。

14、优选地，所述步骤s2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过pcr扩增，与pet 32a载体连接后，转化至tg1感受态细胞中，再将构建好的质粒转化bl21(de3)中，经过iptg诱导表达，使用经his标签介导的ni-agorose亲和层析，然后经过superdex 200凝胶介质进行精细纯化。

15、优选地，所述步骤s2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过pcr扩增，与pet 32a载体连接后，转化至ss320感受态细胞中，再将构建好的质粒转化origami b(de3)中，经过iptg诱导表达，使用经his标签介导的ni-agorose亲和层析。

16、优选地，所述步骤s2中，纳米抗体的验证为：以hba1c抗原包被酶标版，3％bsa封闭，pbst洗涤。加入不同浓度稀释的100ul纳米抗体，室温孵育12h，用pbst洗涤5次，加入羊抗羊驼-hrp反应30min，用pbst洗涤5次，加入tmb显色30min，终止后在酶标仪上检测。

17、本发明提供了一种抗hba1c纳米抗体及其应用方法，具备以下有益效果：

18、1、该抗hba1c纳米抗体及其应用方法，能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在hba1c抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。

19、2、利用该抗hba1c纳米抗体制备的hba1c检测试剂盒(荧光免疫层析)能满足以下性能要求：

20、1)线性范围：在4％～14％范围内，临床相关系数r值≥0.990。

21、2)准确度及精密度：相对误差在±12％内。

22、3)最低检测限：≤4％。

技术特征：

1.一种抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述高活性免疫抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因合成后，如seq idno.2所示，所述高活性免疫抗原经过合成并构建到哺乳动物表达载体上，通过pei瞬时转染至293f细胞中表达，再经过his标签纯化抗原。

3.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤a1中，将高活性免疫抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照0.5mg/次的剂量对所述免疫动物进行背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫4次，免疫间隔为2周，所述目的动物为羊驼。

4.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤a3中，以所述cdna为模板进行两轮pcr扩增获得纳米抗体片段的具体方法如下：取免疫动物外周血10ml，分离pbmc并提取rna，经过反转录获得cdna，所用引物为随机引物，如seq id no.3所示，并以获得的cdna为模板进行pcr扩增，以获得纳米抗体基因文库，两轮pcr所用引物分别为seq id no.4与seq id no.5，seq id no.6与seq id no.7。

5.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤a3中，所述展示载体为pad1-10b噬菌体展示载体。

6.根据权利要求1或5所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤a3中，将所述目的动物的纳米抗体片段与所述展示载体连接，而后转化感受态细胞ss320，制备纳米抗体基因文库，再采用辅助噬菌体m13k07感染所述纳米抗体文库制得纳米抗体展示文库。

7.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过pcr扩增，与pet32a载体连接后，转化至tg1感受态细胞中，再将构建好的质粒转化bl21(de3)中，经过iptg诱导表达，使用经his标签介导的ni-agorose亲和层析，然后经过superdex200凝胶介质进行精细纯化。

8.根据权利要求1所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过pcr扩增，与pet32a载体连接后，转化至ss320感受态细胞中，再将构建好的质粒转化origamib(de3)中，经过iptg诱导表达，使用经his标签介导的ni-agorose亲和层析。

9.根据权利要求6所述的抗hba1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，纳米抗体的验证为：以hba1c抗原包被酶标版，3％bsa封闭，pbst洗涤，加入不同浓度稀释的100ul纳米抗体，室温孵育12h，用pbst洗涤5次，加入羊抗羊驼-hrp反应30min，用pbst洗涤5次，加入tmb显色30min，终止后在酶标仪上检测。

10.一种利用如权利要求1所述的制备方法制得的抗hba1c的纳米抗体。

技术总结
本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：S1、构建纳米抗体噬菌体展示文库；S2、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行HbA1c纳米抗体的筛选以及原核表达验证；步骤S1包括如下步骤：制备高活性免疫抗原并免疫目的动物；分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体基因文库以及纳米抗体展示文库。本发明所制得的抗体具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力和独特的抗原决定簇识别位点，能够在HbA1c抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。

技术研发人员：李泓彦,胡利华,范海艳,赖燕晖,梁树旺,李琦
受保护的技术使用者：深圳市艾伟迪生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13