一种基于lambda核酸外切酶构建的基因表达顺序检测方法

本发明涉及时序逻辑电路，具体涉及一种基于lambda核酸外切酶构建的基因表达顺序检测方法。

背景技术：

1、基因表达是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程；时间特异性是基因表达的重要特点之一；按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定时间顺序发生。基因表达顺序的检测对理解基因表达起到促进作用。时序逻辑电路输出状态由当时的输入信号和电路的原来状态共同决定，因此时序逻辑电路具备揭示基因表达的时间特异性能力。

2、现有时序逻辑电路多基于dna链置换实现和物理策略实现。然而在一些天然或合成的dna电路中，酶因其具有催化能力强，反应速度快的特点，为合成分子电路的构建提供了丰富的工具，扩展了设计空间；目前缺少一种以酶为基础实现时序逻辑电路。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种基于lambda核酸外切酶构建的基因表达顺序检测方法，其可以实现信号控制和输入顺序检测功能，减少了序列间的约束，提高了序列设计的灵活性。

2、为实现上述目的，本技术提出一种基于lambda核酸外切酶构建的基因表达顺序检测方法，包括：

3、步骤1：在设计dna序列时，碱基atgc排列分布均匀，即不能多个相同碱基连续相连，每种碱基含量占比在25％左右；

4、步骤2：构建基于lambda核酸外切酶的yes门，所述yes门包括底物p2和λ核酸外切酶；底物p2通过单链3b*d*和单链inh2退火形成；所述单链3b*d*分为域3和域b*d*两个功能域，域3是λ核酸外切酶的水解触发域，在域3的5’端有磷酸化修饰。

5、当没有输入信号存在时，底物p2和λ核酸外切酶几乎不反应，没有输出信号产生。这是因为仅有底物p2和λ核酸外切酶存在时，λ核酸外切酶对磷酸化单链水解缓慢或者不水解，短时间内无法释放输出信号inh2。当输入信号z2存在时，输入信号z2与底物p2通过互补域杂交形成稳定的三链体；该三链体在域3的5’端是粘性末端，符合λ核酸外切酶的水解条件。因此，λ核酸外切酶会迅速从域3的5’端结合三链体，从磷酸化修饰开始逐步水解链3b*d*，依次释放输入信号z2和输出信号inh2。

6、步骤3：在yes门的基础上设计inhibit门；当加入控制链时，inhibit门可以抑制激活链的产生输出；所述inhibit门包括三个模块：用于接收处理激活信号并释放输出信号的响应ⅰ模块；用于阻止输出信号释放的抑制ⅰ模块；用于接收控制信号并产生抑制信号的抑制产生ⅱ模块，inhibit门实现了对输入信号的控制功能。图6a示意性的描述了三个模块与激活信号i1以及控制信号i2之间的关系。控制信号i2作用于抑制产生ⅱ模块产生抑制信号，该抑制信号通过抑制ⅰ模块实现对响应ⅰ模块的抑制；此时引入激活信号i1，不会有输出o1产生。仅有单独加激活信号i1时，才会产生输出信号。

7、基于λ核酸外切酶构建的inhibit门如6b所示。响应ⅰ模块包括复合物s1和底物d1，其中复合物s1是通过链z1、o1以及dbca退火形成的复合物；底物d1是一条单链，属于关键底物，既可以参与响应ⅰ模块的反应又可以参与抑制ⅰ模块的反应。添加激活信号i1时，i1和底物s1通过toeholda进行链置换，同时底物d1通过暴露的toeholdb进一步置换出输出信号o1。抑制产生ⅱ模块包括底物p2和λ核酸外切酶，加入控制信号i2时，λ核酸外切酶在i2的辅助下水解底物p2并释放抑制信号inh2，该抑制信号inh2和d1完全杂交，形成稳定双链，可以实现抑制功能，导致d1无法通过链置换产生输出信号o1。

8、步骤4：在实现信号控制的基础上，构建一种具有交叉抑制功能的时序逻辑电路，用于检测两个信号相对输入顺序，并且第一个信号在激活对应输出信号时抑制第二个信号响应，提供信号控制功能。由图8a所示流程图可知，该时序逻辑电路包括六个部分:响应ⅰ部分用于接收输入信号i1并释放输出信号o1，响应ⅱ部分用于接收输入信号i2并释放输出信号o2；抑制ⅰ部分用于阻止输出信号o1释放，抑制ⅱ部分用于阻止输出信号o2释放；抑制产生ⅰ部分和抑制产生ⅱ部分用于产生抑制信号；当先加入输入信号i1时，输入信号会同时作用于响应ⅰ部分和抑制产生ⅰ部分，在输入信号i1的帮助下，响应ⅰ部分和抑制产生ⅰ模块分别产生输出信号和抑制信号，同时响应ⅰ部分也可以作用于抑制产生ⅰ部分产生抑制信号，该抑制信号可以作用于抑制产生ⅱ部分，对底物d1进行消耗。此时加入输入信号i2，由于抑制产生ⅱ部分已经成功对响应ⅱ部分进行抑制，所以无法产生相应的输出信号。同理，当先输入信号i2，再输入信号i1时，只会产生与输入信号i2对应的输出信号，没有与输入信号i1对应的输出信号。由此可见，该电路实现了交叉抑制的功能。

9、交叉抑制反应原理示意图如8b所示，响应ⅰ部分包括复合物s1和底物d1，所述复合物s1通过dbca、c*b*和d*e退火形成；响应ⅱ部分包括复合物s2和底物d2，复合物s2通过4231、3*2*和4*5退火形成；单链底物d1不仅是响应ⅰ部分的底物，也是抑制ⅰ部分的底物；单链底物d2不仅是响应ⅱ部分的底物，也是抑制产生ⅱ部分的底物；所述抑制产生ⅰ部分包括双链底物p1和λ核酸外切酶，所述双链底物p1通过c2*4*和a*c*退火形成，其中链c2*4*的5’端有磷酸化修饰；抑制产生ⅱ部分包括双链底物p2和λ核酸外切酶，所述双链底物p2通过3b*d*和1*3*退火形成，其中链3b*d*的5’端有磷酸化修饰；输入信号i1可以通过toeholda和复合物s1发生链置换，继而底物d1可以通过暴露出的toeholdb进行链置换，产生输出信号o1以及副产物w1。输入信号i1不仅可以参与响应ⅰ部分的反应，还可以作用于抑制产生ⅰ部分。输入信号i1会与复合物p1杂交，符合λ核酸外切酶的水解条件，λ核酸外切酶在输入信号i1的辅助下释放输入信号i1和抑制信号inh1，该抑制信号inh1和底物d2杂交形成稳定的双链，构成抑制产生ⅱ部分的反应。输入信号i1和底物s1发生链置换的产物z1，通过域c和底物p1进行杂交，辅助λ核酸外切酶水解，产生抑制信号。此时加入输入信号i2时，i2和复合物s2通过toehold1进行链置换，但是由于底物d2已经被消耗，因此无法产生对应的输出信号o2。同理，当先输入i2，再输入i1时，只会产生与i2对应的输出。由此可见，该电路实现了交叉抑制的功能，此外本电路可以用于检测基因顺序的检测，第一个基因表达式，会产生对应的输出信号，同时对第二个基因的表达进行抑制。

10、本发明采用的以上技术方案，与现有技术相比，具有的优点是：

11、1、输入链不仅可以通过链置换产生输出，还可以在lambda核酸外切酶的帮助下释放抑制链，提供信号控制功能。

12、2、lambda核酸外切酶的引入避免抑制生成部分的触发链和输出链直接接触，减少了序列间的约束，提高了序列设计的灵活性。

13、3、设计的抑制生成部分得益于lambda核酸外切酶的高效水解能力，可以提供很好的抑制效果，增强了信号控制能力。

14、4、以酶为基础实现时序逻辑电路，并且能提供信号控制和输入顺序检测功能，丰富了时序逻辑电路在基因表达的应用。