新型抗-SIRPa抗体及其治疗应用的制作方法

新型抗-sirpa抗体及其治疗应用
1.本技术是申请日为2017年04月14日、申请号为201780023581.2(国际申请号为pct/ep2017/059071)、名称为“新型抗-sirpa抗体及其治疗应用”的发明专利申请的分案申请。
2.本发明涉及免疫疗法领域。本发明提供了新型抗-sirpa抗体，其能够特异性地降低sirpa与cd47之间的相互作用而不影响sirpg与cd47之间的相互作用。
3.针对适应性免疫的免疫检查点已经在对抗多种癌症中显示出巨大治疗效果，但是该治疗效果只在有限比例的患者中。对骨髓细胞(巨噬细胞、树突细胞、mdsc、pmn)的免疫检查点的研究仍然不足，而这些细胞代表许多实体瘤中最丰富的免疫细胞类型并且通常与不良结果相关联。
4.信号调节蛋白α或sirpa(也称为sirpα、cd172a或shps-1)在单核细胞、大多数组织巨噬细胞亚群、粒细胞、淋巴组织中的树突细胞亚群、一些骨髓祖细胞和神经元上不同水平表达，在脑的富含突触的区域中具有显著的高表达，例如小脑的颗粒层和海马。sirpa是密切相关的sirp蛋白的sirp配对受体家族的原型成员。编码人sirpa的基因是多态基因，并且在人群中有几种变体被描述。最常见的蛋白质变体是sirpa v1和v2(登录号np_542970(p78324)和caa71403)。人sirp的多态性导致表面暴露的氨基酸发生变化，但这不影响与cd47的结合。
5.由骨髓细胞表达的sirpa与普遍存在的受体cd47的相互作用是先天反应的重要免疫检查点，涉及骨髓功能的调节。sirpa与cd47的相互作用被大量描述并提供了抑制宿主细胞吞噬作用的下调信号。cd47在大多数健康细胞中以较低水平广泛地表达，但在一些癌细胞中也过表达。因此，cd47起到“别吃我”的信号作用。cd47和sirpa还参与了许多其他相互作用。cd47-sirpa相互作用的最佳表征生理功能之一是其在造血细胞(特别是红细胞和血小板)的体内平衡中的作用。由于cd47是“别吃我”的信号，因此是宿主细胞吞噬作用(通过巨噬细胞)的重要决定因素，近年来cd47-sirpa相互作用在癌细胞清除中的潜在贡献得到了深入研究。结果表明，肿瘤中cd47受体的丰度与患者总体存活率呈负相关，并且构成了几种癌症类型的不良预后因素。
6.如今，sirpa/cd47途径受到不同的药物开发以增强巨噬细胞的吞噬作用。事实上，与受感染的细胞一样，癌细胞携带异常的货物，如不常见的蛋白质或异常水平的正常蛋白质，但这些细胞经常通过同时过表达免疫调节分子来破坏先天免疫控制机制。很明显，这样的机制涉及cd47，一种由正常细胞表达的“自身”蛋白质。cd47与sirpa相互作用，并导致“别吃我”信号传递给吞噬巨噬细胞，然后使靶细胞不受影响。即使癌细胞被治疗性抗体包裹，癌细胞过表达cd47使得它们对巨噬细胞具有抗性，并且癌细胞过表达cd47与许多实体肿瘤和血液癌症中的不良临床结果相关。在实验模型中，特别是在免疫缺陷小鼠中的人肿瘤-异种移植模型中，通过靶向cd47的试剂阻断cd47/sirpa途径对于促进巨噬细胞的肿瘤清除和减少癌细胞的传播和转移形成是非常有效的。通过增强巨噬细胞的抗体依赖性吞噬作用，通过靶向cd47的试剂阻断cd47/sirpa途径已被描述为与耗尽治疗性抗癌抗体如曲妥珠单抗(抗-her2)、西妥昔单抗(抗-egfr)、利妥昔单抗(抗-cd20)和阿仑单抗(抗-cd52)协同作
用。
7.然而，最近显示，靶向cd47的试剂(抗-cd47或sirpa-fc)呈现与cd47生理作用相关的血液学毒性(贫血或血小板减少症)。
8.此外，cd47也与sirp家族的另一成员sirp-γ(也称为sirpg、sirpγ、cd172g或sirpβ2)结合，sirp-γ存在于人t细胞表面上而不在人骨髓细胞上。sirpg是近3500万年前古代世界灵长类动物中的sirpb基因复制的结果，并在t淋巴细胞上以限制性方式表达，与骨髓细胞上的sirpa表达相反。小鼠中不存在sirpg。已经表明，sirpg-cd47相互作用介导细胞-细胞粘附、增强超抗原依赖性t细胞介导的增殖，以及共刺激t细胞活化(piccio等，blood，105：6，2005)。
9.由于sirpa和sirpg之间(特别是在与cd47相互作用的区域)的序列高度相似性，现有技术中公开的抗-sirpa抗体也结合sirpg并在人体中具有不良作用，例如抑制t细胞增殖和降低免疫应答。由于已知抗体的测试是在不具有sirpg基因因而不存在这样的副作用的小鼠模型中进行的，因此无法预测抗-cd47或非选择性抗-sirpa抗体的这种副作用。
10.因此，本领域仍然需要新的和改进的试剂，特别是抗体，以用于安全的免疫疗法，特别是针对癌症，靶向先天免疫细胞而对t细胞免疫应答没有有害影响。特别地，需要抑制sirpa-cd47相互作用而不影响sirpg-cd47相互作用。本发明人藉由本文公开的发明而向前迈出了重要的一步。
11.本发明的目的是通过提供新的试剂(特别是抗体)来满足这种需要，使得可以全部或部分地解决上述问题。
12.在此，发明人提供新型抗-sirpa抗体，特别是人源化抗体，其拮抗sirpa-cd47相互作用但不特异性结合sirpg，因此不影响sirpg-cd47相互作用。
13.本发明的抗体尤其具有以下优点：
[0014]-由于sirpa表达受限(不与人红细胞(rbc)和血小板结合)，它们避免了血液学毒性；
[0015]-它们减少肿瘤生长并改变单一疗法中的肿瘤微环境；
[0016]-它们与检查点抑制剂和共刺激剂呈现协同作用；
[0017]-它们诱发持久的和强大的抗肿瘤记忆t淋巴细胞应答；
[0018]-它们促进人类t细胞免疫应答，是sirpa-cd47相互作用的选择性拮抗剂，而不干扰cd47/sirpg的相互作用。出乎意料的是，尽管sirpa和sirpg序列之间具有高度序列同一性，但本发明人提供了这样的选择性抗体。
[0019]
基于这些特征所选择的这些新型抗体特别适用于许多治疗应用，特别是用于治疗癌症，包括炎性癌症和具有浸润性骨髓细胞(特别是具有浸润性mdsc和/或tam细胞)的癌症。
[0020]
sirpa抗体(具有表位)
[0021]
一方面，本发明涉及一种抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少一种肽，该肽包含选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0022]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与相关领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0023]
为方便起见，提供了说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语和短语的含义。
[0024]
如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体。
[0025]
如本文所用，“单克隆抗体”意指具有共同的重链氨基酸序列和共同的轻链氨基酸序列的抗体分子、抗体的制剂，这与含有不同氨基酸序列的抗体混合物的“多克隆”抗体制剂相反。单克隆抗体可以通过几种已知技术产生，例如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及由杂交瘤衍生的抗体举例说明的经典方法。因此，术语“单克隆”指衍生自一个核酸克隆的所有抗体。
[0026]
本发明的抗体包括重组抗体。如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组方法制造、表达、产生或分离的抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库中分离的抗体；从动物(例如小鼠)中分离的抗体，其因人免疫球蛋白基因而是转基因的；或以任何其他方式制造、表达、产生或分离的抗体，其中特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他dna序列组装。重组抗体包括，例如嵌合抗体和人源化抗体。
[0027]
如本文所用，“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中来自哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的可变结构域的序列被移植到来源于另一种哺乳动物物种(例如人)的种系的恒定结构域的序列上。
[0028]
如本文所用，“人源化抗体”是指这样的抗体，其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列被移植到人框架序列上。
[0029]
如本文所用，“抗体的抗原结合片段”是指抗体的一部分，即，对应于本发明抗体结构的一部分的分子，其可能以自然状态表现出对sirpa的抗原结合能力；与相应的四链抗体的抗原结合特异性相比，这种片段尤其对所述抗原表现出相同或基本相同的抗原结合特异性。有利地，该抗原结合片段具有与相应的四链抗体相似的结合亲和力。然而，相对于相应的四链抗体具有降低的抗原结合亲和力的抗原结合片段也包括在本发明内。可以通过测量抗体和靶片段之间的亲和力来确定抗原结合能力。这些抗原结合片段也可称为抗体的“功能片段”。
[0030]
抗体的抗原结合片段是包含其称为cdr(互补决定区)或其部分的高变域的片段，其包括抗原的识别位点，即，sirpa的胞外域，从而确定抗原识别特异性。
[0031]
四链免疫球蛋白的每个轻链可变结构域和每个重链可变结构域(分别为vl和vh)具有三个cdr，分别称为vl-cdr1(或lcdr1)、vl-cdr2(或lcdr2)、vl-cdr3(或lcdr3)和vh-cdr1(或hcdr1)、vh-cdr2(或hcdr2)、vh-cdr3(或hcdr3)
[0032]
技术人员能够通过参考所述的这方面的标准定义来确定抗体的各个区域/结构域的位置，包括参考编号系统、参考kabat的编号系统或通过应用imgt“collier de perle”算法。在这方面，关于本发明序列的定义，应注意，区域/结构域的界定可以从一个参考系统变化到另一个。因此，本发明中定义的区域/结构域包括在抗体可变结构域的全长序列内的相关序列的长度或定位变化显示为约+/-10％的序列。
[0033]
基于四链免疫球蛋白的结构，抗原结合片段因此可以通过与现有数据库和现有技术中的抗体序列进行比较来定义，尤其是通过比较这些序列中功能结构域的位置来定义，
注意到对于各种类型的抗体，特别是对于igg，特别是对于哺乳动物igg，框架和恒定结构域的位置被明确定义。这种比较还涉及与抗体的三维结构有关的数据。
[0034]
为了说明本发明具体实施方案，含有包含所述抗体的cdr的可变结构域的抗体的抗原结合片段包括fv、dsfv、scfv、fab、fab'、f(ab')2。fv片段由通过疏水相互作用结合在一起的抗体的vl和vh结构域组成；在dsfv片段中，vh：vl异质二聚体通过二硫键稳定；在scfv片段中，vl和vh结构域通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白质。fab片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体可获得的单体片段；它们包含整个l链，以及h链的vh-ch1片段，通过二硫键结合在一起。f(ab')2片段可以通过胃蛋白酶消化铰链二硫化物下的抗体产生；它包含两个fab'片段，另外还包含免疫球蛋白分子的一部分铰链区。fab'片段可通过切割铰链区中的二硫键由f(ab')2片段获得。f(ab')2片段是二价的，即它们包含两个抗原结合位点，如天然免疫球蛋白分子；另一方面，fv(构成fab的可变部分的vhvl调节剂(vhvl dimmer))、dsfv、scfv、fab和fab'片段是单价的，即它们包含单个抗原结合位点。本发明的这些基础抗原结合片段可以组合在一起以获得多价抗原结合片段，例如双抗体、三抗体或四抗体。这些多价抗原结合片段也是本发明的一部分。
[0035]
如本文所用，术语“双特异性”抗体是指通过拥有至少一个对第一抗原特异的区域(例如，来源于第一抗体的可变区)和至少对第二抗原特异的第二区域(例如，来源于第二抗体的可变区)而识别两种不同抗原的抗体。双特异性抗体特异性结合两种靶抗原，因此是多特异性抗体的一种。识别两种以上不同抗原的多特异性抗体可以通过重组dna方法制备，或者包括但不限于通过任何便捷的方法化学制备的抗体。双特异性抗体包括能够识别两种不同抗原的所有抗体或抗体的缀合物，或聚合形式的抗体。双特异性抗体包括被还原和重组以保留其二价特征的抗体，以及被化学偶联使得它们可以具有针对每种抗原的几个抗原识别位点的抗体，例如bime(双特异性巨噬细胞增强抗体)、bite(双特异性t细胞衔接器(bispecific t cell engager))、dart(双亲和重新靶向)；dnl(对接和锁定(dock-and-lock))、dvd-ig(双可变结构域免疫球蛋白)、has(人血清白蛋白)、kih(杵臼结构(knobs into holes))。
[0036]
因此，本发明的双特异性抗体针对sirpa和第二抗原。
[0037]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的双特异性的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物。
[0038]
开发治疗性抗体的一些研究已经导向设计fc区以优化抗体性质，从而允许产生更适合于它们所需的药理学活性的分子。抗体的fc区介导其血清半衰期和效应子功能，例如补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。位于ch2和ch3结构域之间界面的几个突变，例如t250q/m428l和m252y/s254t/t256e+h433k/n434f，表现出增强对fcrn的结合亲和力和体内igg1的半衰期。然而，增加的fcrn结合性和改善的半衰期之间并不总具有直接关系。提高治疗性抗体功效的一种方法是增加其血清持久性，从而允许更高的循环水平、更低的施用频率和减少的剂量。可能需要工程化fc区来降低或增加抗体的效应子功能。对于靶向细胞表面分子的抗体，特别是免疫细胞上的那些，需要消除效应子功能。相反，对于用于肿瘤学用途的抗体，增强效应子功能可以改善治疗活性。四种人igg同种型以不同的亲和力结合活化的fcγ受体(fcγri、fcγriia、fcγriiia)、抑制性fcγriib受体和补体的第一组分(c1q)，产生非常不同的效应子
功能。igg与fcγr或c1q的结合取决于位于铰链区和ch2结构域中的残基。ch2结构域的两个区域对于fcγr和c1q的结合是关键的，且在igg2和igg4中具有独特的序列。
[0039]
如本文所用，“经修饰的抗体”对应于包含抗体或其抗原结合片段的分子，其中所述单克隆抗体或其功能片段与功能性不同的分子结合。本发明的经修饰的抗体可以是融合嵌合蛋白或由任何合适形式的连接而得到的缀合物，合适形式的连接包括共价连接、接枝(grafting)、与化学基团或生物基团或与分子(例如peg聚合物或适于在体内保护免受蛋白酶切割的另一种保护基团或分子)的化学键合，用于改善抗体或功能片段的稳定性和/或半衰期。使用类似的技术，特别是通过化学偶联或接枝，可以用生物活性分子制备经修饰的抗体，所述活性分子例如选自毒素，特别是假单胞菌外毒素a、植物毒素蓖麻毒素或皂草素毒素的a链，尤其是治疗性活性成分，适用于将抗体或功能片段靶向人体特定细胞或组织的载体(尤其包括蛋白质载体)，或者它可以与标记物或接头结合，尤其是当使用抗体片段时。抗体或其功能片段的peg化是特别令人感兴趣的实施方案，因为它改善了活性物质向宿主的递送条件，特别是对于治疗应用。peg化可以是位点特异性的，以防止干扰抗体或功能片段的识别位点，并且可以用高分子量的peg进行。peg化可以通过抗体或功能片段的序列中存在的游离半胱氨酸残基或通过抗体或功能片段的氨基序列中所添加的游离半胱氨酸残基来实现。
[0040]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的经修饰的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物。
[0041]
本发明的大分子包含抗体及其片段，但也包含人工蛋白质、肽和任何能够结合抗原的模拟抗体的化合物(也称为抗原结合抗体模拟物)。这些蛋白质包括亲和素(affitins)和anticalins。affitins是具有选择性结合抗原能力的人工蛋白质。它们在结构上衍生自在sulfolobus acidocaldarius(属于古细菌属结构域的微生物)中发现的dna结合蛋白sac7d。通过随机化sac7d结合表面上的氨基酸，例如，通过产生对应于sac7d结合界面的11个残基的随机取代的变体，可以生成亲和素文库并使得到的蛋白质文库经历多轮核糖体展示，亲和力可以针对各种靶标，例如肽、蛋白质、病毒和细菌。affitins是抗体模拟物，正在开发作为生物技术中的工具。它们还被用作各种酶的特异性抑制剂(krehenbrink等，j.mol.biol.，383：5，2008)。技术人员可以使用本领域已知的方法容易地发展具有所需结合特性的anticalin，特别是如专利申请wo2008068637和上述出版物中所公开的方法，特别是噬菌体展示和/或核糖体展示文库的产生以及使用本文公开的抗原进行的筛选。anticalin是人工蛋白质，能够与抗原结合，与蛋白质或小分子结合。它们是衍生自天然结合蛋白的家族的人脂笼蛋白的抗体模拟物。anticalin约小8倍，大小约180个氨基酸，质量约20kda(skerra，febs j.，275：11，2008)。已经产生了anticalin噬菌体展示文库，其允许筛选和选择anticalin，特别是具有特异性结合特性的anticalin。本领域技术人员可以使用本领域已知的方法容易地开发具有所需结合特性的affitins，特别是如ep专利ep1270725 b1、美国专利us8536307 b2，(schlehuber和skerra，biophys.chem.，96:2-3，2002)和上述出版物中所公开的方法，特别是噬菌体展示和/或核糖体展示文库的产生以及使用本文公开的抗原进行的筛选。anticalin和affitins都可以在包含细菌表达系统的许多表达系统中产生。因此，本发明提供具有本文所述抗体特征的affitins、anticalin和其他类似的抗体模拟物，特别是关于与sirpa的结合，sirpa和cd47之间的相互作用的抑制，不
结合sirpg，不结合t细胞，不抑制t细胞的增殖，不抑制sirpg和cd47之间的相互作用，所有这些都被认为是本发明的大分子。
[0042]
关于本文公开的抗体或其片段的所有实施方案经必要的变型后转换为本发明的大分子，特别是抗原结合抗体模拟物。
[0043]
如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的抗原部分。蛋白质抗原的表位可以分为两类，构象表位和线性表位。构象表位对应于抗原氨基酸序列的不连续区段。线性表位对应于来自抗原的连续氨基酸序列。
[0044]
在本发明中，存在于sirpa内且被抗-sirpa抗体结合的肽构成这些抗体特异性识别的表位。
[0045]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少两种、三种、四种或五种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0046]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合包含以下氨基酸序列(或由以下氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)以及至少一种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0047]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0048]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少一种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：7(greliynqkegh)、seq id no：8(kfrkgspddve)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0049]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合如下的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：7(greliynqkegh)、seq id no：8(kfrkgspddve)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0050]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少一种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：seq id no：1(slipvgp)、seq id no：9(areliynqkegh)、seq id no：10(kfrkgspdte)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0051]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合如下的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：9(areliynqkegh)、seq id no：10(kfrkgspdte)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0052]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少一种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：11(greliyn)、dve、seq id no：12(htvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0053]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合如下的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：11(greliyn)、dve、seq id no：12(htvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0054]
在一个实施方案中，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合至少一种包含选自下组的氨基酸序列(或由选自下组的氨基酸序列组成)的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：13(areliyn)、seq id no：12(htvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0055]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合如下的肽：sirpa中的seq id no：1(slipvgp)、seq id no：13(areliyn)、seq id no：12(htvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)。
[0056]
以下的肽对应于线性表位：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4,seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12和seq id no：13。
[0057]
本发明人通过基于阵列的寡肽扫描(有时称为重叠肽扫描或胃蛋白酶分析)鉴定了这些线性表位。该技术使用来自靶蛋白的重叠和非重叠区段的寡肽序列文库，并测试它们结合目标抗体的能力。通过组合来自靶蛋白的不同部分的非相邻肽序列并对该组合肽施加构象刚性(例如使用clips支架)(timmerman等，2007，j mol recognit.，9月-10月；20(5)：283-99)，可以以非常高的可靠性和精确度定位不连续表位(gaseitsiwe等，2010-clin vaccine immunol.1月；17(1)：168
–
175)。本发明的所有测试抗体，包括heflb，特异性结合所述表位。
[0058]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自由以下构成的组的肽：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)、seq id no：71(rnnmdfsirign)和seq id no：72(sprditlkw)。
[0059]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含以下的肽(或由以下的肽组成)：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)、seq id no：71(rnnmdfsirign)和seq id no：72(sprditlkw)。
[0060]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自由以下构成的组的肽：seq id no：70(eliynqkeghfpr)和seq id no：71(rnnmdfsirign)。
[0061]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含以下的肽(或由以下的肽组成)：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)和seq id no：71(rnnmdfsirign)。
[0062]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自由以下构成的组的肽：sirpa中的seq id no：73(ynqk)和“sir”。
[0063]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含sirpa中的seq id no：73(ynqk)所示的氨基酸序列的肽和sir氨基酸序列的肽，或所述构象表位由sirpa中的seq id no：73(ynqk)所示的氨基酸序列的肽和sir氨基酸序列的肽组成。
[0064]
seq id no：70、seq id no：71、seq id no：72、seq id no：73和sirp的肽对应于构象表位。如本领域技术人员所熟知的(van de water等，clinical immunology and immunopathology，1997，85卷)，本发明人已经使用蛋白水解保护方法(酶消化：胰凝乳蛋白酶，亲和层析固定的抗体-抗原复合物的胰蛋白酶)确定了这些构象表位，然后用质谱分析(maldi-tof/tof)检测和测序这些目标肽。使用的抗原是人sirpa(登录号np_542970)，并且所用的本发明的抗体之一是heflb变体。
[0065]
根据本发明的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性地结合所述构象表位，所述构象表位在天然sirpa内以其构象排列包含所述肽(或由所述肽组成)。
[0066]
seq id no：73(ynqk)中所示的氨基酸序列的肽对应于由登录号为np_542970的人sirpa氨基酸序列中第80-83位氨基酸组成的肽。
[0067]
sir氨基酸序列的肽(sir肽)对应于由登录号为np_542970的人sirpa氨基酸序列中第105-107位氨基酸组成的肽。
[0068]
如本文所用，术语“sirpa”是指来自哺乳动物物种的sirpa蛋白，优选人sirpa(例如，登录号np_542970(p78324)和caa71403)。
[0069]
如本文所用，术语“抗-sirpa抗体”是指特异性结合sirpa，特别是人sirpa的抗体。
[0070]
本发明的抗体或其抗原结合片段与表位(或包含表位的区域)之间的特异性结合意味着抗体对特定蛋白质或抗原(此处为sirpa)的表位(包含表位的区域)表现出明显的亲和力。“明显的亲和力”包括具有约10-9
m(kd)以上亲和力的结合。优选地，当结合亲和力在10-9
m和10-12
m之间，任选地在10-9
m和10-10
m之间，特别是10-10
m时，认为结合是特异性的。尤其是通过将所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除靶蛋白之外的蛋白质或抗原的反应相比较，可以容易地测试结合结构域是否与靶标特异性反应或与靶标结合。
[0071]
可以通过本领域技术人员熟知的各种方法确定亲和力。这些方法包括但不限于biacore分析、blitz分析和scatchard图。
[0072]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗
原结合抗体模拟物，其对sirpa的kd值(特别是通过biacore分析)低于10-9
m，优选低于10-10
m，更优选低于1.10-11
m。
[0073]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其降低sirpa和cd47之间的相互作用。
[0074]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其部分地或完全地，特别是完全地抑制cd47与sirpa的结合，特别是人cd47与人sirpa的结合。
[0075]
本发明的这种抗体特异性结合sirpa并拮抗sirpa和cd47之间的相互作用。
[0076]
特别地，在结合测定中，与阴性对照分子相比，本发明的抗-sirpa拮抗物抗体能够将cd47与sirpa的结合降低或抑制至少50％、60％、70％、优选80％，更优选90％或最优选100％。
[0077]
特别地，在结合测定中，与阴性对照分子相比，本发明的抗-sirpa拮抗物抗体能够将cd47与sirpa的结合减少或抑制50％至100％，优选60％至90％，更优选70％至80％。
[0078]
通过竞争性抑制确定抗体特异性和亲和力的方法是本领域已知的(参见，例如，harlow等，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，ny(1998)；colligan等，免疫学现行方案(current protocols in immunology),green publishing assoc.,ny(1992；1993)；muller，meth.enzym.，92:589-601(1983))并在下面的实施例中描述。
[0079]
这些方法包括但不限于biacore分析、blitz分析、流式细胞术和elisa测定。
[0080]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体，其通过elisa在cd47与抗-sirpa抗体间的竞争性sirpa结合测定中测定的ic 50低于500ng/ml，特别是低于400ng/ml、300ng/ml、更特别是低于200ng/ml。
[0081]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体，其通过对人单核细胞的cd47与抗-sirpa抗体间的竞争性细胞计数测定法测定的ic 50低于500ng/ml，特别是低于400ng/ml、300ng/ml、更特别是低于200ng/ml，低于150ng/ml，甚至更特别是低于100ng/ml。
[0082]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不特异性结合sirpg，优选不特异性结合人sirpg。
[0083]
本发明的这种抗体不影响或不阻止sirpg和cd47之间的相互作用。
[0084]
如本文所用，术语“sirpg”涉及来自哺乳动物物种，优选人sirpg的信号调节蛋白γ(也称为sirpγ、cd172g或sirpβ2)。
[0085]
用于本技术实施例的人sirpg蛋白的参考序列对应于登录号q9p1w8的序列。
[0086]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其对sirpg的kd值(特别是通过blitz分析)高于10-9
m，优选高于10-8
m，更优选高于10-7
m。
[0087]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不显著抑制、拮抗cd47与sirp-g的结合，其对于cd47与sirpg的结合没有显著竞争。
[0088]
可以用本技术实施例中定义的方法确定该拮抗作用。
[0089]
在本发明中，如果所述抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)在blitz
的sirpg结合竞争性测定中没有诱导cd47的kd值增加或诱导的增加低于1log，则可以认为该抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)没有拮抗cd47与sirpg的结合。
[0090]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不特异性结合t细胞，特别是cd3+t细胞。
[0091]
特别地，本发明的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物不结合来自哺乳动物物种的t细胞，特别是人t细胞。
[0092]
特别地，如果在从健康供体的pbmc分离的人t细胞群中，所述抗-sirpa抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)识别的人t细胞群小于10％，优选小于5％，更优选小于2％，最优选小于1％，则可以认为该抗-sirpa抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)不特异性结合人t细胞。
[0093]
该效果可以通过本技术实施例中描述的方法测量。
[0094]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不会显著抑制优选来自哺乳动物物种，更优选来自人t细胞的t细胞，特别是cd3+t细胞的增殖。
[0095]
特别地，如果与阴性对照相比，t细胞增殖的减少小于30％，优选小于20％，更优选小于10％，最优选小于5％，则认为抗-sirpa抗体不显著抑制t细胞的增殖。
[0096]
t细胞的增殖可以通过各种方法确定。例如，t细胞的增殖可以通过加入h3-胸苷来测量，如本技术的实施例中所述。
[0097]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不显著抑制、拮抗表面活性蛋白与sirp-a的结合，其相对表面活性蛋白与sirpa的结合没有显著竞争。
[0098]
如本文所用，“表面活性蛋白”是含胶原的c型(钙依赖性)凝集素，其显著促进表面活性剂稳态和肺免疫(综述参见kishore等，表面活性蛋白sp-a和sp-d：结构、功能和受体，mol immunol，43(9)，1293-315，2006)。
[0099]
如本文所用，术语“表面活性蛋白”是指来自哺乳动物物种的表面活性蛋白，优选人表面活性蛋白。
[0100]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不抑制人表面活性蛋白d(sp-d)与sirpa的结合。
[0101]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不抑制人表面活性蛋白a(sp-a)与sirpa的结合。
[0102]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其不拮抗表面活性蛋白和sirpa之间的相互作用。
[0103]
可以使用本领域技术人员熟知的方法，通过竞争性测定来确定sirpa和表面活性蛋白之间的竞争。这些方法包括但不限于biacore分析、blitz分析和elisa测定。
[0104]
在本发明中，如果所述抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)在blitz的sirpa结合竞争性测定中没有诱导表面活性蛋白的kd值增加或诱导的增加低于1log，则可以认为该抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)没有拮抗表面活性蛋白与sirpa的结合。
[0105]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗
原结合抗体模拟物，其弱结合或不特异性结合sirpb。
[0106]
如本文所用，术语“sirpb”是指来自哺乳动物物种的sirpb蛋白(也称为sirpβ，信号调节蛋白β-1，sirp-β-1，cd172抗原样家族成员b或cd172b)，优选人sirpb。
[0107]
在本技术的实施例中使用的人sirpb蛋白的一个参考序列对应于与登录号q5tfq8-1相关的序列。
[0108]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其对sirpb的kd值(特别是通过blitz分析)高于10-9
m，优选高于10-8
m。
[0109]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0110]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0111]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0112]
其中所述cdr定义如下：
[0113]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0114]-hcdr2，包含seq id no：15(nidpsdsdthynqkfkd)或seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0115]-hcdr3，包含seq id no：17(ggtgtmawfay)、seq id no：18(ggtgtlawfay)、seq id no：19(ggtgtmayfay)或seq id no：20(ggtgtlayfay)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0116]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0117]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0118]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0119]
18d5/变体a/变体b
[0120]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0121]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0122]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0123]
其中所述cdr定义如下：
[0124]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0125]-hcdr2，包含seq id no：15(nidpsdsdthynqkfkd)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0126]-hcdr3，包含seq id no：17(ggtgtmawfay)所示氨基酸序列或由其组成，
[0127]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0128]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0129]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0130]
变体c
[0131]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0132]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0133]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0134]
其中所述cdr定义如下：
[0135]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0136]-hcdr2，包含seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0137]-hcdr3，包含seq id no：17(ggtgtmawfay)所示氨基酸序列或由其组成，
[0138]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0139]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0140]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0141]
变体e
[0142]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0143]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0144]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0145]
其中所述cdr定义如下：
[0146]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0147]-hcdr2，包含seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0148]-hcdr3，包含seq id no：18(ggtgtlawfay)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0149]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0150]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0151]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0152]
变体f
[0153]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0154]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0155]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0156]
其中所述cdr定义如下：
[0157]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0158]-hcdr2，包含seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0159]-hcdr3，包含seq id no：19(ggtgtmayfay)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0160]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0161]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0162]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0163]
变体ef
[0164]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0165]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0166]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0167]
其中所述cdr定义如下：
[0168]-hcdr1，包含seq id no：14(sywvh)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0169]-hcdr2，包含seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0170]-hcdr3，包含seq id no：20(ggtgtlayfay)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0171]-lcdr1，包含seq id no：21(rssqslvhsygntyly)所示的氨基酸序列或由其组成，
[0172]-lcdr2，包含seq id no：22(rvsnrfs)所示的氨基酸序列或由其组成，以及
[0173]-lcdr3，包含seq id no：23(fqgthvpyt)所示的氨基酸序列或由其组成。
[0174]
本发明的抗-sirpa抗体可具有重链可变区，其包含本文提供的人抗体的hcdr1和/或hcdr2和/或hcdr3的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含本文提供的人抗体的lcdr1和/或lcdr2和/或lcdr3的氨基酸序列。
[0175]
在一个实施方案中，抗体包含所提供的人抗体的一个或多个cdr的氨基酸序列变体，该变体包含cdr残基内或附近的一个或多个氨基酸插入和/或cdr残基内或附近的缺失和/或cdr残基的取代(取代是产生此类变体的优选氨基酸变换类型)。
[0176]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0177]-重链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列(或由选自以下的氨基酸序列组成)：seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：28、seq id no：29和seq id no：30，和/或
[0178]-轻链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列(或由选自以下的氨基酸序列组成)：seq id no：31、seq id no：32和seq id no：33。
[0179]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0180]-重链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列(或由选自以下的氨基酸序列组成)：seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：28、seq id no：29和seq id no：30，和
[0181]-轻链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列(或由选自以下的氨基酸序列组5成)：seq id no：31、seq id no：32和seq id no：33。
[0182]
在下表1中给出具体可变结构域的序列。
[0183]
表1.本发明的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的例子
[0184][0185][0186]
本发明中例示的抗体的可变结构域的序列可以从表2中所示序列的组合而演绎出。
[0187]
表2.本发明的特异性抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域
[0188][0189]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域含有氨基酸序列seq id no：33或由氨基酸序列seq id no：33组成。
[0190]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0191]-轻链可变结构域，其包含氨基酸序列seq id no：33或由其组成，以及
[0192]-重链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no:27、seq id no：28、seq id no：29和seq id no：30，
[0193]
优选地
[0194]-重链可变结构域，其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：seq id no：29和seq id no：30，
[0195]
更优选地
[0196]-重链可变结构域，其包含氨基酸序列seq id no：30或由其组成，
[0197]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0198]-重链可变结构域，其包含seq id no：24所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0199]-轻链可变结构域，其包含seq id no：31所示的氨基酸序列或由其组成，
[0200]
或
[0201]-重链可变结构域，其包含seq id no：25所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0202]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0203]
或
[0204]-重链可变结构域，其包含seq id no：25所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0205]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成，
[0206]
或
[0207]-重链可变结构域，其包含seq id no：26所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0208]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0209]
或
[0210]-重链可变结构域，其包含seq id no：26所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0211]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成，
[0212]
或
[0213]-重链可变结构域，其包含seq id no：27所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0214]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0215]
或
[0216]-重链可变结构域，其包含seq id no：27所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0217]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成，
[0218]
或
[0219]-重链可变结构域，其包含seq id no：28所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0220]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0221]
或
[0222]-重链可变结构域，其包含seq id no：28所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0223]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成，
[0224]
或
[0225]-重链可变结构域，其包含seq id no：29所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0226]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0227]
或
[0228]-重链可变结构域，其包含seq id no：29所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0229]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成，
[0230]
或
[0231]-重链可变结构域，其包含seq id no：30所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0232]-轻链可变结构域，其包含seq id no：32所示的氨基酸序列或由其组成，
[0233]
或
[0234]-重链可变结构域，其包含seq id no：30所示的氨基酸序列或由其组成，和
[0235]-轻链可变结构域，其包含seq id no：33所示的氨基酸序列或由其组成。
[0236]
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物没有取代重链可变结构域中第33位的氨基酸w(w33)，所述位置被识别于seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：28、seq id no：29或seq id no：30，和/或没有取代轻链可变结构域中第39位的氨基酸y(y39)、第55位的r(r55)和/或第60位的f(f60)，所述位置被识别于seq id no：31、seq id no：32或seq id：33，特别地，在重链可变结构域中在位置w33处没有取代，在轻链可变结构域中在位置y39、r55和f60处没有取代。
[0237]
在本发明中，可以用任何重链恒定结构域和轻链恒定结构域生产抗体。
[0238]
在一个实施方案中，本发明的抗-人sirpa抗体是人源化单克隆抗体，特别地，其中抗体轻链恒定结构域衍生自人κ轻链恒定结构域，更特别地，其中轻链恒定结构域由seq id no：35的序列组成，并且其中抗体的重链恒定结构域衍生自人igg1、igg2、igg3或igg4(野生
型或突变型)重链恒定结构域，特别衍生自人igg4重链恒定结构域，更特别地，其中抗体的重链恒定结构域由seq id no：34的序列组成。
[0239]
如本领域技术人员所熟知的，重链恒定结构域的igg同种型的选择集中在是否需要特定功能和对合适的体内半衰期的需求。例如，设计用于选择性根除癌细胞的抗体通常需要活性同种型，其允许通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性进行补体活化和效应子介导的细胞杀伤。人igg1和igg3(半衰期较短)同种型均满足这些标准，特别是人igg1同种型(野生型和变体)。特别地，取决于重链恒定结构域的igg同种型(特别是人类野生型和变体igg1同种型)，本发明的抗-人sirpa抗体可通过cdc、adcc和/或adcp机制对表达sirpa的细胞具有细胞毒性(salfeld，自然生物技术，卷25，n
°
12，2007；irani等，分子免疫学，卷67，第2期，a部分，2015)。事实上，可结晶片段(fc)区域与多种辅助分子相互作用以介导间接效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。
[0240]
表3.适用于本发明的抗体的重链恒定结构域和轻链恒定结构域的例子
[0241][0242]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体，其包含：
[0243]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：56或由其组成，和
[0244]-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：57或由其组成，
[0245]
或
[0246]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：36或由其组成，和
[0247]-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：43或由其组成，
[0248]
或
[0249]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：37或由其组成，和
[0250]-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，
[0251]
或
[0252]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：37或由其组成，和
[0253]-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：45或由其组成，
[0254]
或
[0255]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：38或由其组成，和
[0256]-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，
[0257]
或
[0258]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：38或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列
seq id no：45或由其组成，或
[0259]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：39或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，或
[0260]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：39或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：45或由其组成，或
[0261]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：40或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，或
[0262]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：40或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：45或由其组成，或
[0263]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：41或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，或
[0264]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：41或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：45或由其组成，或
[0265]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：42或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：44或由其组成，或
[0266]-重链，其包含氨基酸序列seq id no：42或由其组成，和-轻链，其包含氨基酸序列seq id no：45或由其组成。
[0267]
表4.本发明的特异性抗体的重链序列和轻链序列
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272][0273]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其能够诱导单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化成非抑制性细胞。
[0274]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中所述非抑制性细胞分泌促炎细胞因子如il6、il12和tnf，以及没有或低水平的抗炎细胞因子如il10和tgfβ。
[0275]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中所述非抑制性细胞表达inos。
[0276]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中所述非抑制性细胞不表达mhc ii类标志物并表达标志物cd80-cd86。
[0277]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中所述非抑制性细胞表达自然杀伤(nk)细胞的至少一种标志物。
[0278]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制巨噬细胞的m2极化，和/或促进促炎性m1型巨噬细胞。
[0279]
本发明的抗体可以改变巨噬细胞极化以诱发促炎环境，即，它们可以抑制由m2型巨噬细胞提供的抗炎信号和/或促进由m1型巨噬细胞提供的促炎信号。该方法使得可以重建有利于t效应细胞作用的炎性环境，特别是在癌细胞消除中。
[0280]
sirpa抗体
[0281]
对于本发明其他方面中列举的抗体，重复经必要的变更后的如上定义的抗体的实施方案。
[0282]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自下组的肽：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)、seq id no：71(rnnmdfsirign)和seq id no：72(sprditlkw)。
[0283]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含以下的肽或由以下的肽组成：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)、seq id no：71(rnnmdfsirign)和seq id no：72(sprditlkw)。
[0284]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自下组的肽：seq id no：70(eliynqkeghfpr)和seq id no：71(rnnmdfsirign)。
[0285]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，
其特异性结合构象表位，所述构象表位包含以下的肽或由以下的肽组成：sirpa中的seq id no：70(eliynqkeghfpr)和seq id no：71(rnnmdfsirign)。
[0286]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含至少一种选自下组的肽：seq id no：73(ynqk)和sir。
[0287]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其特异性结合构象表位，所述构象表位包含以下的肽或由以下的肽组成：sirpa中的seq id no：73(ynqk)和sir。
[0288]
另一方面，本发明涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其包含：
[0289]
a)重链，包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或
[0290]
b)轻链，包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，
[0291]
其中所述cdr定义如下：
[0292]-hcdr1，包含氨基酸序列seq id no：14(sywvh)的肽或由其组成，
[0293]-hcdr2，包含氨基酸序列seq id no：15(nidpsdsdthynqkfkd)或seq id no：16(nidpsdsdthyspsfqg)的肽或由其组成，
[0294]-hcdr3，包含氨基酸序列seq id no：17(ggtgtmawfay)、seq id no：18(ggtgtlawfay)、seq id no：19(ggtgtmayfay)或seq id no：20(ggtgtlayfay)的肽或由其组成，
[0295]-lcdr1，包含氨基酸序列seq id no：21(rssqslvhsygntyly)的肽或由其组成，
[0296]-lcdr2，包含氨基酸序列seq id no：22(rvsnrfs)的肽或由其组成，以及
[0297]-lcdr3，包含氨基酸序列seq id no：23(fqgthvpyt)的肽或由其组成。
[0298]
本发明还涉及抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合和/或其不抑制t细胞的增殖和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0299]
应用
[0300]
另一方面，本发明涉及以下物质：
[0301]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0302]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0303]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0304]
用作药物。
[0305]
本发明还涉及治疗有此需要的受试者的方法，包括给予所述受试者有效量的以下物质：
[0306]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0307]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0308]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0309]
本发明还涉及以下物质在制药中的应用：
[0310]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0311]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0312]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0313]
另一方面，本发明涉及用于治疗病症的以下物质：
[0314]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0315]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0316]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0317]
其中，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防。
[0318]
如本文所定义的，“易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防的病症”对应于包括炎性癌症的癌症和具有浸润性骨髓细胞(特别是具有浸润性mdsc和/或tam细胞)的癌症、传染病、创伤、自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、1型糖尿病、狼疮、牛皮癣)、疫苗接种、慢性炎症性疾病(如炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化或移植功能障碍。
[0319]
本发明还涉及治疗有此需要的受试者的病症的方法，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下物质：
[0320]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0321]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0322]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0323]
本发明还涉及以下物质在制备用于治疗病症的药物中的应用：
[0324]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0325]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的
结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0326]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0327]
其中，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防。
[0328]
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗病症的以下物质：
[0329]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0330]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0331]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0332]
其中，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防。
[0333]
实际上，sirpa作为检查点抑制剂并参与巨噬细胞极化。特别地，由于巨噬细胞的促炎作用是以2型巨噬细胞为代价而获得的(m2型高吞噬活性＝m(il4))，因此阻断sirpa诱发了与1型巨噬细胞相关的巨噬细胞的促炎功能(m1促炎症＝m(ifng))并且抑制了肿瘤中巨噬细胞的抑制活性。因此，sirpa的拮抗剂能够抑制巨噬细胞的m2表型极化和/或有利于促炎性m1型巨噬细胞的功能，并且可以用于治疗。
[0334]
如本文所定义的，“易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防的病症”对应于例如实体癌、液体癌、传染病、创伤、自身免疫疾病、疫苗接种、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症或慢性炎症性疾病。
[0335]
本发明还涉及治疗有此需要的受试者的病症的方法，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下物质：
[0336]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0337]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0338]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0339]
在一个实施方案中，本发明还涉及以下物质在制备用于治疗病症的药物中的应用：
[0340]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0341]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0342]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细
胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0343]
其中，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防。
[0344]
改变巨噬细胞的极化以促进促炎细胞可用于许多病理或病况。如上所述，该改变特别适用于癌症，以恢复巨噬细胞的抗肿瘤活性和/或预防m2型巨噬细胞的促肿瘤活性。由于过量的m2型巨噬细胞极化导致的不适当的免疫应答也发生在传染病、纤维化、疫苗接种、创伤和慢性炎性疾病中。
[0345]
因此，根据一个具体实施方案，抗-sirpa抗体可用于治疗患有癌症的个体，所述癌症选自肺癌、间皮瘤癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、肉瘤、胰腺癌、头颈癌、肾癌、胸腺瘤、胶质瘤、黑色素瘤和血液系统癌症，例如淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、白血病如t和b急性或慢性淋巴细胞白血病(all或cll)或者急性或慢性髓性白血病(aml或cml)和骨髓瘤。
[0346]
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗病理状况的以下物质：
[0347]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0348]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0349]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0350]
其中，所述病理状况选自癌症(特别是炎性癌症和具有浸润性骨髓细胞(尤其是浸润性mdsc和/或tam细胞)的癌症，)传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍。
[0351]
在一个实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自癌症(特别是炎性癌症和具有浸润性骨髓细胞(尤其是浸润性mdsc和/或tam细胞)的癌症)、传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下物质：
[0352]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0353]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0354]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0355]
在一个实施方案中，本发明还涉及以下物质在制备用于治疗病理状况的药物中的应用：
[0356]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0357]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的
结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0358]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0359]
其中，所述病理状况选自癌症(特别是炎性癌症和具有浸润性骨髓细胞(尤其是浸润性mdsc和/或tam细胞)的癌症)、传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍。
[0360]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物用于如上定义的用途，其中，向出现sirpa阳性肿瘤的患者施用本发明的所述抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物。
[0361]
在一个实施方案中，本发明涉及用于疫苗接种的以下物质：
[0362]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0363]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0364]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0365]
在一个实施方案中，本发明涉及疫苗接种受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的以下物质：
[0366]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0367]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0368]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0369]
在一个实施方案中，本发明涉及以下物质在制备疫苗中的应用：
[0370]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0371]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0372]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0373]
抑制性骨髓细胞限制了疫苗接种的有效性，特别是在幼儿中。因此，抗-sirpa/g会限制抗-sirpa对疫苗应答所提供的益处，阻止t淋巴细胞响应疫苗接种。
[0374]
本发明的抗体或其抗原结合片段可以以多种合适的途径给药，例如静脉内(iv)、皮下(sc)或肌内(im)施用至受试者。
[0375]
抗体或其抗原结合片段可以单独给药或与另一种治疗剂组合给药，例如第二种人单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体与另一种药剂一起施用，例如免疫
抑制剂、红细胞生成刺激剂(esa)，与治疗性细胞组合物等组合。
[0376]
在一个实施方案中，本发明涉及用于如上定义的用途的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或其抗原结合抗体模拟物，其中，抗-sirpa抗体或抗原结合片段与第二治疗剂组合。
[0377]
特别地，本发明的抗-sirpa抗体可以与一些其他潜在策略组合，其中所述其他潜在策略使用临床开发中的或市售的药剂来克服肿瘤免疫逃避机制(参见antonia等，免疫肿瘤学组合：临床经验和未来前景的综述，clin.cancer res.off.j.am.assoc.cancer res.20，6258
–
6268，2014的表1)：
[0378]
1-例如，通过使用抗-ctla4、抗-pd1或抗-pd-l1分子，逆转适应性免疫的抑制(阻断t细胞检查点途径)；
[0379]
2-例如通过使用拮抗剂分子(包括拮抗剂抗-cd137(抗-4-1bb)抗体或cd137(4-1bb)配体)靶向cd137(4-1bb)，开启适应性免疫(使用拮抗剂分子(特别是抗体)促进t细胞共刺激受体信号传导)；
[0380]
3-改善先天免疫细胞的功能；
[0381]
4-例如通过基于疫苗的策略，激活免疫系统(增强免疫细胞效应子功能)。
[0382]
第二治疗剂的施用可以与抗-sirpa抗体同时施用或不同时施用。取决于第二治疗剂的性质，共同施用可以以组合药物(产品)的形式制备，也称为“组合”。组合是固定剂量的组合，其包括以单一剂型组合的两种以上活性药物成分，其以固定的剂量制造和分散。但是剂量方案和/或给药途径也可以不同。
[0383]
在优选的实施方案中，该第二治疗剂选自化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、细胞治疗剂(例如car-t细胞)、抗生素和益生菌。
[0384]
特别地，可用于本发明上下文的免疫治疗剂选自治疗性疫苗(dna、rna或肽疫苗)、免疫检查点阻断剂或激活剂，特别是适应性免疫细胞(t或b淋巴细胞)或免疫偶联物如抗体-药物偶联物的免疫检查点阻断剂或激活剂。
[0385]
如本文所用，术语“免疫治疗剂”特别是指可以将癌症疫苗从有趣的生物学现象转变成有效治疗剂的药剂，包括：增加初始t细胞数量和t细胞库(repertoire)的t细胞生长因子、增加树突细胞(dc)数量的生长因子、激活dc和其他抗原提呈细胞(apc)的拮抗剂、允许和增加癌症疫苗的佐剂、激活和刺激t细胞的拮抗剂、t细胞检查点阻断的抑制剂，增加免疫t细胞生长和存活的t细胞生长因子，抑制、阻断或中和癌细胞和免疫细胞来源的免疫抑制细胞因子的药剂。
[0386]
许多免疫检查点阻断剂或活化剂是本领域已知的。在本发明的上下文中，可用的适应性免疫细胞(b或t淋巴细胞)的免疫检查点阻断剂或活化剂的例子是抗-pdl1、抗-pd1、抗-ctla4、抗-cd137、抗-cd2、抗-cd28、抗-cd40、抗-hvem、抗-btla、抗-cd160、抗-tigit、抗-tim-1/3、抗-lag-3、抗-2b4和抗-ox40、抗-cd40拮抗剂、cd40-l、tlr拮抗剂、抗-icos、icos-l和b细胞受体拮抗剂，特别是抗-pdl1、抗-pd1、抗-cd137。
[0387]
所述免疫治疗剂还可以是靶向肿瘤抗原的抗体，特别是选自抗-her2、抗-egfr、抗-cd20、抗-cd19、抗-cd52的抗体。
[0388]
抗体可以以约1ng/kg体重至约30mg/kg体重以上的有效剂量提供。在具体的实施方案中，剂量可以为1μg/kg至约20mg/kg，可选地为10μg/kg至10mg/kg或100μg/kg至5mg/kg。
[0389]
术语“有效剂量(dose)”或“有效剂量(dosage)”或“有效量”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“有效剂量”意指包含足以治愈或至少部分地阻止患有疾病的患者的该疾病及其并发症的量。该应用的有效量或有效剂量将取决于待治疗的病症、递送的抗体构建体、治疗的背景和目标、疾病的严重程度、前期治疗、患者的临床病史和对治疗剂的反应、给药途径、患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或情况(年龄和总体健康状况)，以及患者自身免疫系统的总体状态。可以调节适当的剂量，使得其可以一次给药或通过一系列给药施用至患者，并且为了获得最佳治疗效果。
[0390]
可以根据需要重复用于此目的的剂量，例如每日、半周、每周、半月、每月或根据复发期间的需要。
[0391]
在一个方面，本发明还涉及用于诊断测试(特别是个性化医疗，更特别是伴随诊断测试)的以下物质：
[0392]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0393]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0394]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0395]
在一个实施方案中，本发明涉及一种诊断方法，特别是在个性化医疗中，更特别是在伴随诊断测试中，使用以下物质：
[0396]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0397]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0398]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0399]
在一个实施方案中，本发明涉及以下物质在制备用于诊断测试(特别是个性化医疗，更特别是伴随诊断测试)的药物中的应用：
[0400]-如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或
[0401]-抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其抑制cd47与sirpa的结合并且不与sirpg特异性结合，和/或其不与t细胞特异性结合，和/或其不抑制t细胞的增殖，和/或其不抑制cd47与sirpg的结合，
[0402]
特别地，其抑制cd47与sirpa的结合并且其不与sirpg特异性结合，并且其不与t细胞特异性结合，并且其不抑制t细胞的增殖，并且其不抑制cd47与sirpg的结合。
[0403]
在一个方面，本发明还涉及体外或离体诊断方法，特别是适用于个性化医疗(更特别是伴随诊断)的诊断方法，其中，本发明的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或其抗原结合模拟物用于检测预先从受试者获得的样品中的sirpa+细胞，以及可选地用于定量sirpa的表达。
[0404]
在一个方面，本发明还涉及本发明的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物在制备适用于诊断测试(特别是用于个性化医疗或伴随诊断测试)的药物中的应用。
[0405]
一方面，本发明还涉及至少一种本发明的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物作为用于测定预先从个体获得的生物样品中sirpa的表达和/或表达水平的手段的应用。
[0406]
在一个方面，本发明还涉及一种体外或离体测定方法，用于从预先从所述受试者获得的生物样品中测定受试者的sirpa阳性细胞，所述方法包括：
[0407]
i)使用本发明的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，在预先从所述受试者获得的生物样品中体外测定sirpa的表达和/或表达水平。
[0408]
一方面，本发明还涉及至少一种本发明的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物在方法中的应用(特别是体外或离体)，其中sirpa用作可预测受试者(特别是癌症受试者)对治疗的反应的生物标志物。
[0409]
在一个方面，本发明还涉及预测癌症受试者对治疗的反应的体外或离体方法，特别是用本发明的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，所述方法包括：
[0410]-确定预先从受试者获得的肿瘤样品中sirpa的表达水平，特别是用本发明的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，以及
[0411]-将sirpa的表达水平与代表无应答受试者群体中sirpa表达水平的值相比较，
[0412]
其中，受试者的肿瘤样品中sirpa表达水平较高代表受试者对治疗有响应。
[0413]
在一个方面，本发明还涉及测定预先从受试者获得的样品中sirpa+细胞的存在的体外或离体方法，其包括确定sirpa作为生物标志物的存在，所述生物标志物预测受试者对治疗的反应，特别是被诊断患有癌症的受试者的反应，其中所述方法包括：
[0414]-测定预先从受试者获得的肿瘤样品中sirpa的表达水平，特别是用如权利要求1-13中任一项所定义的抗-人sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，以及
[0415]-将sirpa的表达水平与代表无应答受试者群体中sirpa表达水平的值相比较，
[0416]
其中，受试者的肿瘤样品中sirpa表达水平较高代表患者对治疗有反应。
[0417]
组合物
[0418]
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上定义的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
[0419]
如本文所用，“药物组合物”意指包含适合施用至受试者或患者(例如哺乳动物，尤其是人)的组合物。通常，“药物组合物”是无菌的并且通常不含能在受试者体内引起不希望的反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药物级的)。药物组合物可以被设计用于通过许多不同的给药途径施用至有需要的受试者或患者，给药途径包括口服、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、气管内等。
[0420]
如本文所用，“药学上可接受的载体”意在包括可用于制备药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂，所述药物组合物通常是安全的、无毒的、既不是生物学上也不是其他方面不良的，并包括可用于兽医用途以及人类药物用途的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。如本文所用的“药学上可接受的载体”包括一种和多于一种这样的赋形剂、稀释剂，载体和佐剂。
[0421]
特别地，本发明涉及一种药物组合物，其包含作为活性成分的如上定义的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
[0422]
组合产品
[0423]
另一方面，本发明涉及一种治疗手段，特别是组合产品手段，其包含以下物质作为活性成分：如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物和第二治疗剂，其中所述活性成分被配制用于单独的、连续的或组合的治疗，特别是用于组合或连续使用。
[0424]
特别地，本发明涉及一种组合产品，其包含如上定义的抗-sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物和第二治疗剂，用于同时、单独或连续使用药物。
[0425]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品，其中第二治疗剂选自化学治疗剂、放射治疗剂、细胞治疗剂、免疫治疗剂、抗生素和益生菌。
[0426]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品，其中所述免疫治疗剂选自治疗性疫苗、免疫检查点阻断剂或活化剂，特别是适应性免疫细胞(t或b淋巴细胞)和抗体-药物偶联物的免疫检查点阻断剂或激活剂。
[0427]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品，其中适应性免疫细胞(t和b淋巴细胞)的所述免疫检查点阻断剂或活化剂选自由以下组成的组：抗-pdl1、抗-pd1、抗-ctla4、抗-cd137、抗-cd2、抗-cd28、抗-cd40、抗-hvem、抗-btla、抗-cd160、抗-tigit、抗-tim-1/3、抗-lag-3、抗-2b4和抗-ox40、抗-cd40拮抗剂、cd40-l、tlr拮抗剂、抗-icos、icos-l和b细胞受体拮抗剂，特别是选自抗-pdl1、抗-pd1、抗-cd137。
[0428]
在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是靶向肿瘤抗原的抗体，特别是选自抗-her2、抗-egfr、抗-cd20、抗-cd19、抗-cd52的抗体。
[0429]
一方面，本发明涉及如上定义的组合产品，其用于同时、单独或连续治疗病症，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防。
[0430]
在一个实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的受试者的病症的方法，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防，所述方法包括同时、单独或连续向所述受试者施用有效量的如上定义的组合产品。
[0431]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品在制备用于治疗病症的药物中的应用，所述病症易于通过将单核细胞的髓源性抑制细胞(mo-mdsc)分化为非抑制性细胞而被改善或预防。
[0432]
一方面，本发明涉及如上定义的组合产品，其用于同时、单独或连续治疗病症，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防。
[0433]
在一个实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的受试者的病症的方法，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防，所述方法包括同时、单独或连续向所述受试者施用有效量的如上定义的组合产品。
[0434]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品在制备用于治疗病症的药物中的应用，所述病症易于通过将巨噬细胞极化改变为促炎性巨噬细胞而被改善或预防。
[0435]
一方面，本发明涉及如上定义的组合产品，其用于同时、单独或连续治疗病理状况或用于疫苗接种，所述病理状况选自癌症、传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍。
[0436]
在一个实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自癌症、传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍，所述方法包括同时、单独或连续向所述受试者施用有效量的如上定义的组合产品。
[0437]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的组合产品在制备用于治疗病理状况或用于疫苗接种的药物中的应用，所述病理状况选自癌症、传染病、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着症、创伤、疑似休克、慢性传染病(如假单胞菌或cmv)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖、ii型糖尿病和移植功能障碍。
[0438]
核酸
[0439]
另一方面，本发明涉及编码如上定义的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
[0440]
如本文所用，核酸分子可以是双链的和单链的、线性的和环状的。优选地，它包含在载体中，该载体优选包含在宿主细胞中。
[0441]
在一个实施方案中，本发明涉及编码如上定义的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子，所述核酸分子包含至少一种选自以下的序列或由选自以下的序列组成：seq id no：58、seq id no：59、seq id no：60、seq id no：61、seq id no：62、seq id no：63、seq id no：64、seq id no：65、seq id no：66、seq id no：67、seq id no：68和seq id no：69.
[0442]
在一个实施方案中，本发明涉及编码如上定义的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：
[0443]-编码所述抗体的重链可变结构域的序列，优选包含：
[0444]-seq id no：58、seq id no：59或seq id no：60，
[0445]-seq id no：61或seq id no：62，和
[0446]-seq id no：63、seq id no：64、seq id no：65或seq id no：66，
[0447]
和/或
[0448]-编码所述抗体的轻链可变结构域的序列，优选包含：
[0449]-seq id no：67，
[0450]-seq id no：68，和
[0451]-seq id no：69。
[0452]
表5.编码本发明的抗体的重链可变结构域的cdr和轻链可变结构域的cdr的序列
[0453][0454]
5特别地，本发明涉及包含选自以下序列(或由以下序列组成)的核酸分子：seq id no：46、seq id no：47、seq id no：48、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51、seq id no：52、seq id no：53、seq id no：54和seq id no：55。
[0455]
表6.编码本发明的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的序列
[0456]
[0457]
[0458][0459]
载体
[0460]
另一方面，本发明涉及包含如上定义的核酸分子的载体。
[0461]
如本文所用，“载体”是用作将遗传物质转移到细胞中的载体的核酸分子。术语“载体”包括质粒、病毒、粘粒和人工染色体。通常，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择标记。载体本身通常是核苷酸序列，通常是dna序列，其包含插入物(转基因)和用作载体“骨架”的较大序列。目前的载体还可以包括除转基因插入物和骨架之外的其他特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体特异性地用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
[0462]
宿主细胞
[0463]
另一方面，本发明涉及分离的宿主细胞，其包含如上定义的载体。
[0464]
如本文所用，术语“宿主细胞”旨在包括可以是或者已经是载体接受体的任何单个细胞或细胞培养物、外源核酸分子和编码本发明的抗体构建体的多核苷酸；和/或抗体构建体本身的接受体。可以通过转化、转染等方式将各种材料引入细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单个细胞的后代或潜在后代。合适的宿主细胞包括原核或真核细胞，还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如鼠、大鼠、兔、猕猴或人。
[0465]
试剂盒
[0466]
另一方面，本发明涉及一种试剂盒，包括：
[0467]-如上定义的抗体或其抗原结合片段，
[0468]-编码所述抗体或抗原结合的核酸分子，
[0469]-包含所述核酸分子的载体，和/或
[0470]-包含所述载体的细胞。
[0471]
为方便起见，本发明的抗体可以以试剂盒(即，试剂的包装组合)提供。
[0472]
在本发明的上下文中，术语“试剂盒”是指两个以上组分(其中一个对应于本发明的抗体或其抗原结合、核酸分子、载体或细胞)一起包装在容器、接受体或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以实现某个目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。
[0473]
所述试剂盒可包含任何适当形状、大小的一个以上接受体(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋)以及适当剂量的含有本发明抗体构建体的材料用于给药。试剂盒可以另外包含使用说明(例如以小册子或说明书的形式)、施用本发明的抗体构建体的装置，例如注射器、泵、注入器(infuser)等、用于重构本发明的抗体构建体的装置和/或用于稀释本发明的抗体构建体的装置。
[0474]
在一个实施方案中，本发明涉及如上定义的用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可含有包含干燥/冻干的抗体构建体的第一接受体和包含含水制剂的第二接受体。在本发明的某些实施方案中，提供了包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
[0475]
抗原
[0476]
一方面，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含由seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)构成的人sirpa的表位序列或由该表位序列组成。
[0477]
在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含由seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)构成的人sirpa的表位序列或由该表位序列组成，所述多肽的大小为至多300个氨基酸。
[0478]
在一个实施方案中，本发明的多肽的大小为50～300个氨基酸，优选为100～250个氨基酸。
[0479]
在一个实施方案中，本发明的多肽的大小为至多50、100、150、200、250或300个氨基酸。
[0480]
在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含由seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)构成的人sirpa的表位序列和由seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)或seq id no：6(ypqrlqltwle)构成的人sirpa的至少一个表位序列，或由上述表位序列组成。
[0481]
在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含由seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)构成的人sirpa的表位序列，或由该表位序列组成。
[0482]
在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含至少一种选自seq id no：70、seq id no：71和seq id no：72的肽或由其组成，所述多肽由至多300个氨基酸的序列组成。
[0483]
在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，特别是一种抗原，其包含sirpa中的seq id no：73(ynqk)所示的氨基酸序列的肽和/或sir氨基酸序列的肽，或由上述肽组成，所述
多肽由至多300个氨基酸的序列组成。
[0484]
制造抗体的方法
[0485]
一方面，本发明还涉及一种制备抗体(特别是本发明的抗体)的方法，包括使非人动物，特别是非人哺乳动物对至少一种如上定义的抗原免疫，以及特别是从所述免疫的非人动物中收集所得血清，以获得针对所述抗原的抗体。
[0486]
特别地，本发明还涉及一种制备抗体的方法，该方法包括使非人动物对一种抗原免疫，所述抗原包含由seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)构成的人sirpa的表位序列或由该表位序列组成，以及特别是从所述免疫的非人动物中收集所得血清，以获得针对所述抗原的抗体。
[0487]
特别地，本发明还涉及一种制备抗体的方法，包括使非人动物对一种抗原免疫，所述抗原包含由seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)构成的人sirpa的表位序列和选自seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)或seq id no：6(ypqrlqltwle)的人sirpa的至少一个表位序列，或由上述表位序列组成，以及特别是从所述免疫的非人动物中收集所得血清，以获得针对所述抗原的抗体。
[0488]
特别地，本发明还涉及一种制备抗体的方法，包括使非人动物对一种抗原免疫，所述抗原包含由seq id no：1(slipvgp)、seq id no：2(g/areliynqkegh)、seq id no：3(kfrkgspd[dv]/[t]e)、seq id no：4(qhtvsftceshgfsprditlkwf)、seq id no：5(icevahvtlqg)和seq id no：6(ypqrlqltwle)构成的人sirpa的表位序列，或由该表位序列组成，以及特别是从所述免疫的非人动物中收集所得血清，以获得针对所述抗原的抗体。
[0489]
选择抗体的方法
[0490]
一方面，本发明涉及选择本发明的抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物的方法，其包含以下步骤中的至少一个或由以下步骤组成：
[0491]
a.测试(例如，根据实施例1、2和3中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物与sirpa(特别是如上定义的抗原)结合的能力，
[0492]
b.测试(例如，根据实施例7和8中描述的方法)抗体，该抗体的抗原结合片段或模拟物与sirpb结合的能力，
[0493]
c.测试(例如，根据实施例9和10中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物与sirpg结合的能力，
[0494]
d.测试(例如，根据实施例4和5中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物抑制人cd47与人sirpa结合的能力；
[0495]
e.测试(例如，根据实施例12中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物与t细胞结合的能力；
[0496]
f.测试(例如，根据实施例13中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物抑制t细胞增殖的能力；
[0497]
g.测试(例如，根据实施例11中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物抑制人cd47与人sirpg结合的能力；
[0498]
以及，可选地包括以下步骤：
[0499]-选择一种抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物，其特异性结合sirpa，特别是结
合如上定义的抗原，并且其显著抑制cd47与sirpa的结合，并且其不与人sirpg特异性结合，和/或其不与人t细胞特异性结合，和/或其不显著抑制人t细胞的增殖，和/或其不显著抑制人cd47与人sirpg的结合；更特别地，其特异性结合sirpa，特别是结合如上定义的抗原，并且其显著抑制cd47与sirpa的结合，并且其不与人sirpg特异性结合，并且其不与人t细胞特异性结合，并且其不显著抑制人t细胞的增殖，并且其不显著抑制人cd47与人sirpg的结合。
[0500]
选择本发明抗体的方法可以有利地进一步实施本发明抗体的制备方法。
[0501]
提出以下附图和实施例，以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人的发明范围，也不旨在表示以下实验是全部或仅进行的实验。虽然已经参考本发明的特定实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以进行等同替换。另外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、方法步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都在所附权利要求的范围内。
附图说明
[0502]
图1.抗-sirpa抗体通过elisa测定的结合分析(人sirpa-his涂覆和抗人κ检测)。
[0503]
通过elisa对图a中嵌合体(
◆
)、hala(
□
)、hfla(*)、hflb(+)、hefla(
▲
)、heflb(
■
)、sirp29(δ)、kwar23(o)；图b中hcla(
●
)、hclb(x)、hela(
◇
)、helb(-)；图c中halb(-)、hbla(_)、hblb(
■
)的固定化sirpa-his进行评价；用驴抗-人抗体进行显露(revelation)，并使用tmb底物通过比色法在450nm处显示。ed50是标记的抗体在该测定中达到信号的50％的浓度。图d：m18d5克隆(
■
)(n＝4)、se5a5商业克隆(
▲
)(n＝7)、6g10克隆(
▽
)(n＝3)以及12d7克隆(
□
)(n＝4)的结合。
[0504]
图2.通过biacore对人sirpa重组蛋白的抗-sirp抗体的亲和力分析。
[0505]
将sirpa-his重组蛋白以5μg/ml(500ru)固定在cm5芯片上，并以不同浓度添加标记的抗体。3分钟的结合期(ka)、然后10分钟的解离期(kd)后，测量数值，以确定亲和常数(kd)。
[0506]
图3.人单核细胞(sirpa变体1的纯合子(v1/v1))上抗-sirpa抗体的结合分析。
[0507]
(a,b)通过细胞荧光测定法对人单核细胞v1/v1(预先用人fc受体结合抑制剂抗体染色)上的嵌合体(
◆
)、hala(
□
)、hfla(*)、hflb(+)、hefla(
▲
)、heflb(
■
)、sirp29(δ)、kwar23(o)进行评价。在cantoii细胞计数器上用pe标记的小鼠抗-人fc mab进行显露，其值对应于染色的单核细胞的百分比。ed50是标记的抗体在该测定中达到信号的50％的浓度。图a对应于染色的单核细胞v1/v1的百分比。图b对应于单核细胞v1/v1的荧光强度(mfi)的平均值。
[0508]
(c,d)通过流式细胞术(facs)对人单核细胞上的sirpa抗体的结合研究：测试了不同的抗-sirpa抗体：m18d5(
■
)(n＝1)、se7c2(
▲
)(n＝2)、12d7(
□
)(n＝2)、6g10(
◆
)(n＝4)：图c表示不同抗体对剂量反应的平均荧光强度(mfi)。图d表示染色的单核细胞对抗体剂量反应的百分比。在可能的情况下进行统计分析。
[0509]
(e,f,g)通过抗-h sirpa抗体在群体中结合sirpa变体：通过facs用pe-抗小鼠igg测量32名志愿者中不同抗-hsirpa抗体结合sirpa变体的能力。所有克隆均以10μg/ml进行测试：m18d5(
■
)、12d7(
▼
)、6g10(
◆
)和商业抗体se5a5(
□
)、se7c2(δ)。图e表示纯合子变
体1志愿者(n＝16)。图f表示纯合子变体2志愿者(n＝8)。图g表示杂合子v1/v2志愿者(n＝8)。
[0510]
图4.抗-sirpa抗体与cd47在sirpa上的竞争。
[0511]
(a)通过elisa对用恒定浓度的生物素化的cd47-fc(6μg/ml)孵育的不同浓度的嵌合体(
◆
)、hfla(*)、hflb(+)、hefla(
▲
)、heflb(
■
)、sirp29(δ)、kwar23(o)的固定化sirpa-his进行评价。用链霉亲和素过氧化物酶进行显露，以检测cd47分子，并使用tmb底物通过比色法在450nm处显示。第二个实验的结果以ic50值呈现。ic50是标记的抗体在该测定中抑制50％信号的浓度。
[0512]
(b)通过elisa对抗-sirpa抗体对sirpa-cd47相互作用的拮抗活性研究：在剂量反应下测试不同的抗sirpa抗体：m18d5克隆(
■
)(n＝1)、商业抗体se5a5(
▲
)(n＝2)和m12d7(
□
)(n＝2)。该图表示在抗-hsirpa抗体的剂量响应期间通过elisa测量的cd47阳性sirpa-cd47相互作用的百分比。
[0513]
图5.抗-sirpa抗体与cd47在人单核细胞上的竞争。
[0514]
(a,b)通过细胞计数法对在人单核细胞v1/v1上用恒定浓度的生物素化的cd47-fc(10μg/ml)孵育的不同浓度的嵌合体(
◆
)、hfla(*)、hflb(+)、hefla(
▲
)、heflb(
■
)进行评价。用藻红蛋白-链霉亲和素进行显露，以检测cd47分子，并通过cantoii细胞计数器显示。ic50是标记的抗体在该测定中抑制50％信号的浓度。图a对应于阳性细胞的百分比。图b对应于荧光强度的平均值。
[0515]
(c)通过facs对抗-sirpa抗体对sirpa-cd47相互作用的拮抗活性研究：在剂量反应下测试不同的抗sirpa抗体：m18d5克隆(
■
)(n＝1)、商业抗体se7c2(
▲
)(n＝2)和m12d7(
□
)(n＝2)。图c表示在与抗hsirpa抗体竞争后通过facs测量的cd47阳性细胞的百分比。
[0516]
图6.(a)通过blitz对用sp-d配体预温育或不预温育的人sirpa重组蛋白上的抗-sirp抗体的亲和力分析。将sirpa-his重组蛋白以10μg/ml固定在ninta生物传感器上，并以100μg/ml(饱和浓度)加入sp-d配体。然后以20μg/ml加入抗-sirpa抗体，并在120秒的结合期(ka)、接着经过120秒(kd)的解离期后推断亲和力值，以确定亲和常数(kd)。(b)通过blitz对用小鼠18d5抗体预温育的人sirpa重组蛋白上的抗-sirp抗体的亲和力分析。将sirpa-his重组蛋白以10μg/ml固定在ninta生物传感器上，并以20μg/ml(饱和浓度)加入抗-sirpa抗体。然后以100μg/ml加入sp-d配体，并在120秒的结合期(ka)、接着经过120秒(kd)的解离期后推断亲和力值，以确定亲和常数(kd)。
[0517]
图7.(a)通过blitz对人sirpb重组蛋白的抗-sirp抗体的亲和力分析。
[0518]
将sirpb-his重组蛋白固定在ninta生物传感器上，并以20μg/ml加入标记的抗体。在120秒的结合期(ka)、接着经过120秒(kd)的解离期后推断出值，以确定亲和常数(kd)。(b)抗-sirp抗体的结合分析(人sirpb-his涂覆和抗人κ检测)。通过elisa对heflb(
■
)、sirp29(δ)、kwar23(o)、b4b6(
◆
)和igg4 ab对照(
■
)的固定化的sirpb-his进行评价。除用小鼠抗体显露b4b6之外，用驴抗-人抗体进行显露，并使用tmb底物通过比色法在450nm处显示。
[0519]
图8.(a)通过blitz对人sirpg重组蛋白上的抗-sirp抗体的亲和力分析。
[0520]
将sirpg-his重组蛋白固定在ninta生物传感器上，并以10μg/ml加入标记的抗体。在120秒的结合期(ka)、接着经过120秒(kd)的解离期后推断出值，以确定亲和常数(kd)。
(b)通过elisa测定抗-sirp抗体在sirpg上的结合分析(人sirpg-his涂覆和抗人κ检测)。通过elisa对heflb(
■
)、sirp29(δ)、kwar23(o)、lsb2-20(
●
)和igg4 ab对照(
■
)的固定化的sirpb-his进行评价。用驴抗-人抗体进行显露，并使用tmb底物通过比色法在450nm处显示。
[0521]
图9.通过blitz对用抗-sirp抗体预温育的人sirpg重组蛋白上的cd47的亲和力分析。将sirpg-his重组蛋白以10μg/ml固定在ninta生物传感器上，并以20μg/ml(饱和浓度)加入标记的抗体。然后，以100μg/ml加入cd47fc，并在120秒的结合期(ka)、接着经过120秒(kd)的解离期之后推断亲和力值，以确定亲和常数(kd)。
[0522]
图10.用不同单克隆抗体染色并用第二抗-igg荧光抗体显示后，通过流式细胞术在(a)外周人cd3+t细胞、(b)红细胞或(c)血小板上测量的几何平均荧光强度。
[0523]
图11.用不同的单克隆抗体染色后阳性外周人cd3+t细胞的百分比。该表显示了重复实验中阳性细胞的值(％)。
[0524]
图12.(a)(c)用抗-cd3+抗-cd28珠以1：1的比例刺激从健康志愿者的外周血单核细胞分离的人t细胞3天，或(b)(d)用同种异体树突状细胞(dc)以5t细胞：1dc的比例刺激5天，或(e)用不同浓度的结核菌素未纯化的蛋白衍生物(ppd)刺激5天。在培养的第0天加入抗体。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0525]
图13.从首次接受试验的小鼠的脾细胞中分离小鼠cd8+t细胞。用抗-cd3+抗-cd28珠以1：1的比例刺激cd8 t细胞3天。在培养的第0天加入抗体。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0526]
图14.用同种异体树突状细胞(dc)以5t细胞：1dc的比例刺激从健康志愿者的外周血单核细胞分离的人t细胞5天。在培养的第0天加入抗体。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0527]
图15.(a)抗-sirpa(p84克隆)的抗肿瘤作用，在小鼠肝癌的原位模型(an orthotropic model)中(第0天通过门静脉注射的2.5
×
106hepa 1.6细胞)，每周三次腹膜内给药，连续4周(300μg/注射)，不注射或联合两次注射(第4天和第8天)抗4-1-bb mab(3h3克隆，100μg/注射)或注射(每周两次)抗-pdl-1(10f.9g2克隆，200μg/注射，4周内治疗)。当小鼠存活三倍于所有对照小鼠死亡所需的时间时，认为小鼠被治愈。(b)在肿瘤接种后第13天分析肿瘤浸润细胞。(c)在肿瘤接种后第13天分析肿瘤浸润细胞和脾细胞。(d)通过抗sirpa+抗-4-1bb注射而预先在肝癌模型中被治愈的小鼠或用抗-4-1bb治疗的sirpa突变小鼠通过在脾中注射hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)而被再次攻击。以相同途径平行注射首次接受试验的小鼠，以与再次攻击的小鼠比较肿瘤发展。然后不处理小鼠。(e)通过抗sirpa+抗-4-1bb而预先在肝癌模型中被治愈的小鼠通过在脾中注射hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)而被再次攻击，并在再次攻击后30天收取它们的脾。分离脾细胞和t细胞脾细胞。给首次接受试验的小鼠静脉注射载体、全脾细胞(10
×
106细胞/小鼠)或从脾细胞中纯化的t细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)以及全部都在脾中接受hepa1.6细胞注射(2.5
×
106细胞/小鼠)。然后不处理小鼠，当它们存活三倍于所有对照小鼠死亡所需的时间时，认为它们被治愈。
[0528]
图16.通过抗-sirpa+抗-pdl1注射而预先在肝癌模型中被治愈的小鼠通过在脾中注射hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)而被再次攻击。以相同途径平行注射首次接受试
验的小鼠，以与再次攻击的小鼠比较肿瘤发展。然后不处理小鼠。
[0529]
图17.抗-sirpa(p84克隆)的抗肿瘤作用，在小鼠乳腺癌的原位模型中，每周三次腹膜内给药，持续4周(200μg/注射)(在乳腺中注射0.25
×
106的4t1细胞)。通过测量肿瘤直径并根据下式计算：＝(0.52(d2))
1.5
，来评价肿瘤的发展。根据伦理指南，当肿瘤发展接近1000mm3时对小鼠实施安乐死。
[0530]
图18.用抗-sirpa(p84克隆)或ctrl mab处理的小鼠的脾、肿瘤和淋巴结中的免疫细胞表型分析，在小鼠乳腺癌的原位模型中，每周三次腹膜内给药，持续两周(200μg/注射)(在乳腺中注射0.25
×
106的4t1细胞)。在肿瘤接种后两周进行免疫细胞分析。
[0531]
图19.在第0天和第2天以12mg/kg在c57bl/6小鼠中腹膜内施用抗-sirpa(p84克隆)、抗-cd47(miap410克隆)和无关同种型对照。在第0天和第3天在含有edta的管中收集血液样品，并用xs-800i血液分析器(sysmex)进行血细胞计数。在第3天评价血红蛋白的水平(左)和血细胞比容的百分比(右)。虚线表示c57bl/6小鼠中每个参数的正常范围值。
[0532]
图20.(上)与从健康供体的血液中新鲜分离的人血小板上的对照mab(虚线)相比，抗-sirpa(heflb，灰色)和抗-cd47(b6h12，黑色)mab的流式细胞术分析。(下)在50μg/ml对照mab、抗-sirpa(heflb)、抗-cd47(b6h12)或抗-整联蛋白αiib作为聚集抑制剂的阳性对照的存在下，使用光学凝集计测量人血小板聚集。在未活化血小板和adp-活化的血小板上评价抗体。
[0533]
图21.同种异体cd4+t细胞与从(a)新鲜的卵巢癌腹水或(b)冷冻的卵巢癌腹水(使用10μg/ml对照抗体(白)、抗-sirpa heflb(黑)或抗-cd47 mab(灰))中提取的cd14+骨髓细胞(以1：1的比例)一起培养。在第5天通过加入3h-胸苷来测量增殖。(c)或者，同种异体t细胞以5：1的比例与同种异体树突细胞以及不同比例的cd14+骨髓细胞一起培养，cd14+骨髓细胞是在10μg/ml抗体的存在下从卵巢癌腹水中提取的(如(a))。
实施例
[0534]
在以下实施例中，抗体“18d5”(或“m18d5”)对应于小鼠抗体18d5，“嵌合”抗体对应于嵌合小鼠/人18d5抗体，抗体“hala、halb、hbla、hblb、hcla、hclb、hela、helb、hfla、hflb、hefla和heflb“对应于特定的人源化18d5变体。抗体6g10和12d7属于申请人；这些抗体通过与m18d5相同的方法获得，并用作对照。这些对照抗体是igg2a小鼠单克隆抗-人sirpa抗体。
[0535]
另外，商业抗体用作比较。第一种是抗-sirpa抗体，命名为se7c2(santa cruz sc-23863)；第二抗体是能够识别sirpα/β的抗体，并命名为se5a5(biolegend ble323802)；第三种是抗人sirpa抗体，命名为kwar23(creative biolabs)。在pct申请wo2013056352中描述的来自多伦多大学的命名为sirp29的抗人sirpa抗体也用作比较。
[0536]
实施例1.通过elisa对sirpa上的抗sirpa抗体进行结合分析
[0537]
方法：通过elisa评估抗-sirpa抗体的结合活性。对于嵌合抗体、人源化抗体、sirp29和kwar23的elisa测定，将重组hsirpa(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11612-h08h)以0.5μg/ml(碳酸盐缓冲液(ph9.2))固定在塑料上，并加入纯化的抗体以测量结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的驴抗-人igg(杰克逊免疫研究；美国；参考号709-035-149)，并通过常规方法显示。
[0538]
对于使用小鼠抗体的elisa测定，将重组hsirpa(生物制药有限公司，北京，中国；
laboratoring；美国；参考号sa-5004)，以检测生物素-cd47fc结合，并通过常规方法显示。
[0549]
对于小鼠抗体，将纯化的抗体(不同浓度)与0.04μg/ml cd47fc(生物制药有限公司，北京，中国；参考号12283-h02h)在37℃下混合2小时，以测量竞争性结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的驴抗-人fc链(杰克逊免疫研究；参考号709-035-149)，以检测cd47fc结合，并通过常规方法显示。
[0550]
结果：如图4所示，本发明的抗体对sirpa-cd47的相互作用具有拮抗活性。特别地，观察到与sirp29和商业抗-sirpa抗体se5a5的拮抗活性相比，嵌合抗体hfla、hflb、hefla和heflb具有更好的拮抗活性。
[0551]
实施例5.通过拮抗剂细胞荧光测定法测定人单核细胞上的cd47与人源化抗-sirpa抗体之间的竞争性分析
[0552]
方法：为了测量人单核细胞上的cd47与人源化抗-sirpa抗体之间的竞争，在4℃下在单核细胞上加入纯化的抗体15分钟，然后与5μg/ml(终浓度)的生物素化的人cd47fc(acrobiosystems interchim；法国；参考号：#cd7-h82f6)混合，并在4℃温育30分钟，以测量竞争性结合抗体。温育和洗涤后，在4℃下加入pe标记的链霉亲和素(bdbiosciences；美国；参考号554061)15分钟，以检测生物素-cd47fc的结合，并在bd lsrii或canto ii细胞荧光仪上进行分析。
[0553]
为了测量人单核细胞上的cd47与小鼠抗-hsirpa抗体之间的竞争，在4℃下在单核细胞上加入纯化的抗体15分钟，然后与5μg/ml(终浓度)的cd47fc(生物制药有限公司，北京，中国；参考号12283-h02h)混合，并在4℃下温育15分钟，以测量竞争性结合抗体。温育和洗涤后，在4℃下加入fitc标记的抗-人fc(beckman coulter；参考号im1627)15分钟，以检测cd47fc的结合，并在bd lsrii或canto ii细胞荧光仪上进行分析。
[0554]
结果：如图5所示，本发明的抗体对人单核细胞上的sirpa-cd47相互作用具有拮抗活性。
[0555]
实施例6.用sp-d进行blitz法竞争
[0556]
方法：该方法用blitz进行(fort
é
bio；美国；参考号c22-2 no 61010-1)。
[0557]
条件a：sirpa+抗-sirpa抗体+表面活化蛋白d(sp-d)。在第一步中，将sirpa(his)重组蛋白(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11612-h08h)通过组氨酸尾部以10μg/ml固定在ni-nta生物传感器(fort
é
bio；美国；参考号18-0029)中30秒。在第二步中，以20μg/ml(饱和浓度)加入抗-sirpa抗体120秒。然后，人sp-d(r et d systems；美国；参考号1920-sp-050)以100μg/ml结合120秒，与抗-sirpa抗体竞争。在动力学缓冲液中进行120秒sp-d的解离。使用blitz pro 1.2软件进行数据分析，计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和常数kd(ka/kd)。
[0558]
条件b：sirpa+表面活化蛋白d(sp-d)+抗sirpa抗体。在第一步中，将sirp-a(his)重组蛋白(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11612-h08h)通过组氨酸尾部以10μg/ml固定在ni-nta生物传感器(fort
é
bio；美国；参考号18-0029)中30秒。在第二步中，以100μg/ml加入人sp-d(r et d systems；美国；参考号1920-sp-050)120秒。然后，抗-sirpa抗体以20μg/ml(饱和浓度)结合120秒。在动力学缓冲液中进行120秒抗-sirpa抗体的解离。使用blitz pro 1.2软件进行数据分析，计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和常数kd(ka/kd)。
[0559]
结果：如图6所示，抗-sirpa抗体18d5的结合不阻断sp-d与sirpa的结合，并且sp-d的结合不阻断18d5与sirpa的结合。因此，本发明的抗体不抑制sirpa与sp-d之间的相互作用。
[0560]
实施例7.通过blitz法测定抗-sirpa抗体对sirpb的亲和力
[0561]
方法：该方法用blitz进行(fort
é
bio；美国；参考号c22-2 no 61010-1)。将重组hsirpb-his(抗体-在线；美国；参考号abin3077231)以10μg/ml通过组氨酸尾部固定在ni-nta生物传感器(fort
é
bio；美国；参考号18-0029)中30秒。然后，抗-sirpa抗体以20μg/ml结合120秒。在动力学缓冲液中进行120秒抗-sirpa抗体的解离。使用blitz pro 1.2软件进行数据分析，计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和常数kd(ka/kd)。
[0562]
结果：如图7a所示，与sirpa相比，本发明的抗体对sirpb具有较低的亲和力。特别地，注意到与sirp29和kwar23相比，嵌合抗体、hfla、hflb、hefla、heflb对sirpb的亲和力降低。
[0563]
实施例8.sirpb上抗-sirp抗体的elisa结合
[0564]
方法：对于活性elisa测定，将重组hsirpb-his(抗体-在线；美国；参考号abin1466557)以1μg/ml(碳酸盐缓冲液(ph9.2))固定在塑料上，并加入纯化的抗体，以测量结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的驴抗-人igg(杰克逊免疫研究；美国；参考号709-035-149)，并用常规方法显示。
[0565]
结果：如图7b所示，抗-sirpa抗体对sirpb具有低亲和力。必须指出，对于除b4b6(用小鼠抗体显示)之外的所有抗体，用驴抗-人抗体进行显露，这可以解释抗-sirpb抗体b4b6获得的信号低于抗-sirpa抗体获得的信号。
[0566]
实施例9.通过blitz法的抗-sirpa抗体对sirpg的亲和力分析
[0567]
方法：该方法用blitz进行(fort
é
bio；美国；参考号c22-2 no 61010-1)。将重组hsirpg-his(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11828-h08h)以10μg/ml通过组氨酸尾部固定在ni-nta生物传感器(fort
é
bio；美国；参考号18-0029)中30秒。然后，抗-sirpa抗体以20μg/ml结合120秒。在动力学缓冲液中进行120秒抗-sirpa抗体的解离。使用blitz pro 1.2软件进行数据分析，计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和常数kd(ka/kd)。
[0568]
结果：如图8a所示，本发明的抗-sirpa抗体对sirpg具有低亲和力。该亲和力略微弱于已知的抗-sirpa抗体(sirp29和kwar23)的亲和力。然而，抗-sirpa抗体、sirp29和kwar23之间的动力学性质不同，与sirp29和kwar23相比，抗-sirpa抗体具有高解离率常数(kd)。特别地，hflb对sirpg的亲和力最低，其kd值为1.036e-7m，与sirp29和kwar23的kd值相比，相当于2-log的差异。
[0569]
实施例10.抗-sirp抗体在sirpg上的elisa结合
[0570]
方法：对于活性elisa测定，将hsirpg-his(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11828-h08h)以1μg/ml(碳酸盐缓冲液(ph9.2))固定在塑料上，并加入纯化的抗体，以测量结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的驴抗-人igg(杰克逊免疫研究；美国；参考号709-035-149)，并用常规方法显示。
[0571]
结果：如图8b所示，抗-sirpa抗体heflb不结合sirpg，而已知的抗-sirpa抗体sirp29和kwar23显示出与sirpg的显著结合。
[0572]
实施例11.用cd47对sirpg进行blitz法竞争：sirpg+抗-sirpa抗体+cd47
[0573]
方法：该方法用blitz进行(fort
é
bio；美国；参考号c22-2 no 61010-1)。在第一步中，将hsirpg-his(生物制药有限公司，北京，中国；参考号11828-h08h)通过组氨酸尾部以10μg/ml固定在ni-nta生物传感器(fort
é
bio；美国；参考号18-0029)中30秒。在第二步中，以20μg/ml(饱和浓度)加入抗-sirpa抗体120秒。然后，人cd47fc(生物制药有限公司，北京，中国；参考号12283-h02h)以100μg/ml结合120秒，与抗-sirpa抗体竞争。在动力学缓冲液中进行120秒cd47fc的解离。使用blitz pro 1.2软件进行数据分析，计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和常数kd(ka/kd)。
[0574]
结果：如图9所示，本发明的抗-sirpa heflb不竞争cd47与sirpg的结合。相反，其他已知抗体sirp29，特别是kwar23竞争cd47与sirpg的结合。
[0575]
实施例12.通过流式细胞术测定与血细胞的结合
[0576]
方法：实验旨在分析抗-sirpa抗体在人血细胞上的结合。从健康志愿者的纯化血液中提取cd3阳性t淋巴细胞、红细胞和血小板。然后将细胞在4℃下用10微克/ml的每种测试抗体染色30分钟，洗涤，然后用第二荧光抗-igg抗体在4℃再染色30分钟。洗涤后，在canto ii(bd bioscience)流式细胞仪上分析细胞。
[0577]
结果：如图10所示，t细胞、红细胞和血小板对cd47是阳性的，其普遍表达，并且它们用b6h12抗体染色。sirp29和kwar23抗体，如lsb2.20(特异性抗-sirpγ抗体)，与已知表达sirpγ的t细胞结合。然而，抗-sirpa人源化18d5抗体不与t细胞结合(用测试的四种不同18d5人源化变体获得相同结果)。红细胞和血小板不表达sirpa，因此，它们未被人源化18d5抗体和其他抗-sirpa抗体显示。该结果显示，与已知的抗-sirpa抗体相比，人源化18d5抗体对活细胞的sirpa具有特异性。
[0578]
如图11所示，t细胞不被人源化18d5抗体染色(用测试的5种不同18d5人源化变体获得相同结果)和嵌合18d5染色(数据未显示)，而超过70％的t细胞被sirp29和kwar23染色。
[0579]
实施例13.人cd3+t细胞增殖
[0580]
方法：从健康志愿者的血沉棕黄层中分离出hpbmc。使用automacs(miltenyi)通过阳性选择选择cd4或cd8 t细胞，并接种于96孔板(50000细胞/孔)中。增殖信号由抗-cd3/抗-cd28涂覆的微珠(lifetechnologies)(以1个珠子/1个t细胞的比例)在3天内提供，或由体外产生的同种异体成熟树突细胞(以5个t细胞/1个mdc1的比例)在5天内提供，或由不同浓度的结核菌素未纯化蛋白衍生物(ppd)提供5天。从增殖试验开始，以饱和浓度(10μg/ml)加入靶向sirpa/cd47途径的抗体。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0581]
结果：如图12所示，当用抗-cd3+抗cd28珠子(a)(c)或用同种异体树突细胞(b)(d)或用ppd(e)刺激t细胞时，抗-sirpa抗体hala和heflb变体不抑制t细胞的增殖，而当用同种异体树突细胞刺激t细胞时，抗sirpa kwar23抑制t细胞的增殖。如所预期的，抗-cd47抗体和抗-sirpg抗体是t细胞增殖的抑制剂。
[0582]
实施例14.小鼠cd8+t细胞的增殖
[0583]
方法：从首次接受试验的小鼠中分离出脾细胞。使用automacs(miltenyi)通过阳性选择选择cd8 t细胞，并接种于96孔板(50000细胞/孔)中。增殖信号由抗-cd3/抗-cd28涂覆的微珠(lifetechnologies)(以1个珠子/1个t细胞的比例)在3天内提供。从增殖试验开始，以饱和浓度(10μg/ml)加入靶向sirpa/cd47途径的小鼠抗-sirpa抗体(p84)和抗-cd47
抗体(miap310)。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0584]
结果：如图13所示，抗-sirpa或抗-cd47抗体对小鼠t细胞的增殖没有抑制作用。该结果可通过小鼠不表达sirpg基因的事实来解释。因此，小鼠可以用作模型来预测不结合sirpg的特异性抗-sirpa抗体的体内作用。相反，抗-cd47或非选择性抗-sirpa抗体的体内临床前效力(特别是适应性免疫和记忆t淋巴细胞的产生)不能预测人类情况。
[0585]
实施例15.人t细胞的增殖
[0586]
方法：从健康志愿者的血沉棕黄层中分离出hpbmc。使用automacs(miltenyi)通过阳性选择选择cd4或cd8 t细胞，并接种于96孔板(50000细胞/孔)中。增殖信号由抗-cd3/抗-cd28涂覆的微珠(lifetechnologies)(以1个珠子/1个t细胞的比例)在3天内提供，或由体外产生的同种异体成熟树突细胞(以5个t细胞/1个mdc1的比例)在5天内提供。从增殖试验开始，以饱和浓度添加抗体(抗-cd47和抗-sirpa抗体为5μg/ml，抗-pd-1/pd-l1抗体和重组4-1bbl为2.5μg/ml)。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0587]
结果：如图14所示，抗-pd-1/pd-l1抗体和重组4-1bbl对人t细胞的增殖具有增强作用，而抗-cd47对人t细胞的增殖具有不利影响。特别地，抗-cd47抗体阻止抗-pd-1/pd-l1或4-1bb拮抗剂的人t细胞免疫刺激效力。抗-sirpa heflb对t细胞的增殖没有显著影响。
[0588]
实施例16.小鼠中的抗肿瘤作用
[0589]
方法：用甲苯噻嗪/氯胺酮混合物麻醉小鼠。剖腹手术后，通过门静脉注射pbs中的肿瘤hepa 1.6细胞(2.5
×
106个细胞/100μl)。在肿瘤注射后4天，开始治疗。在pbs腹膜内注射hepa 1.6细胞(肝癌细胞，hcc)后，在第4天和第8天注射拮抗性抗-4-1bb单克隆抗体(3h3)两次(100μg/注射)。每周两次在pbs中腹膜内注射抗pdl1单克隆抗体(200μg/注射)，持续4周。在pbs中腹膜内注射的4周期间，每周三次注射拮抗性抗-sirpa抗体(p84)(300μg/注射)。
[0590]
在肿瘤接种后13天，在hcc的原位模型中评估抗肿瘤反应。此时，收集肿瘤和脾，以对浸入肿瘤或全身方式的免疫细胞进行表型分析。用四种不同的混合物染色作为浸润性免疫细胞的肝脏的脾细胞和非实质细胞(npc)，用于流式细胞术获取。
[0591]
结果：如图15a所示，单独的抗-sirpa抗体显著延长了一小部分小鼠(28％)的存活率。与抗-4-1bb或抗-pdl1抗体组合，抗-sirpa抗体甚至允许在停药后存活的小鼠的非常高的反应率
[0592]
如图15b所示，抗-sirpa与共刺激剂(例如抗-4-1bb)或t细胞检查点抑制剂(例如抗-pdl1)的组合通过降低调节和免疫抑制性免疫细胞(tregs，mo-mdsc)来改变肿瘤微环境，同时增加效应记忆cd8+t细胞与抗-4-1bb组合的积累。mo-mdsc的特征在于cd11b阳性和mhc ii类阴性群体中高表达ly6c且不表达ly6g。
[0593]
如图15c所示，通过降低未成熟和初始b细胞的频率，同时增加记忆细胞和浆母细胞的积累，抗-sirpa与共刺激剂(例如抗-4-1bb)或t细胞检查点抑制剂(例如抗-pdl1)的组合改变了肿瘤微环境的细胞组成和脾脏周围的细胞组成。类似地，通过抗-sirpa与抗-41bb或抗-pdl1的组合，细胞溶解(cd27阴性)nk细胞的积累诱发肿瘤和外周。
[0594]
总之，抗-sirpa修饰肿瘤和外周免疫，特别是适应性(t细胞、treg、b细胞)和先天性(mdsc、巨噬细胞、nk细胞)免疫细胞，有助于肿瘤的消除和长期保护。
[0595]
实施例17.预先治愈的小鼠中的抗肿瘤作用
[0596]
方法：通过抗sirpa+抗-4-1bb注射而预先在肝癌模型中被治愈的小鼠或用抗-4-1bb治疗的sirpa突变小鼠通过在脾中注射hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)而被再次攻击。用空气中3％的异氟烷麻醉小鼠。在小鼠侧腹切开并分离脾后，将肿瘤hepa1.6细胞(pbs中)注射到脾中(2.5
×
106细胞/50μl)。以相同途径平行注射首次接受试验的小鼠，以与再次攻击的小鼠比较肿瘤发展。
[0597]
结果：如图15d所示，所有治愈的小鼠在再次攻击时存活，而相反，所有首次接受试验的小鼠死亡。该结果表明记忆t细胞在抗-sirpa治疗下或没有sirpa信号(sirpa突变小鼠)时被诱发，并且在治愈的小鼠中仍然长期存在。
[0598]
实施例18.从预先治愈的小鼠中收集的t细胞脾细胞或全脾细胞的抗肿瘤作用
[0599]
方法：对抗-sirpa+抗-4-1bb再次攻击的治愈的小鼠实施安乐死并收集脾脏。在红细胞裂解后，提取脾细胞并用automacs从脾细胞的一部分中分离cd3阳性t细胞。麻醉后，给小鼠静脉注射t细胞脾细胞(2.5
×
106细胞/100μl)或全脾细胞(10
×
106细胞/100μl)或单独的赋形剂(pbs)。如前所述，所有小鼠通过门静脉接受hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/100μl)。
[0600]
结果：如图15e所示，从治愈的小鼠中收集的脾细胞和分离的t淋巴细胞对小鼠的存活具有高的积极作用。该结果表明，在治疗肝癌后，记忆t细胞存在于治愈小鼠的脾细胞中，并且是长期适应性免疫记忆的原因。
[0601]
实施例19.预先治愈的小鼠中的抗肿瘤作用
[0602]
方法：通过抗sirpa+抗-pdl-1注射而预先在肝癌模型中被治愈的小鼠通过在脾中注射hepa 1.6细胞(2.5
×
106细胞/小鼠)而被再次攻击。用空气中3％的异氟烷麻醉小鼠。在小鼠侧腹切开并分离脾后，将肿瘤hepa 1.6细胞(pbs中)注射到脾中(2.5
×
106细胞/50μl)。以相同途径平行注射首次接受试验的小鼠，以与再次攻击的小鼠比较肿瘤发展。
[0603]
结果：如图16所示，所有治愈的小鼠在再次攻击时存活，而相反，所有首次接受试验的小鼠死亡。该结果表明记忆t细胞仍然存在于治愈的小鼠中。该结果表明记忆t细胞在抗sirpa疗法下被诱发并且仍然在治愈的小鼠中长期存在。
[0604]
实施例20.在乳腺癌模型中肿瘤生长的影响
[0605]
方法：用空气中3％的异氟烷麻醉小鼠。小鼠在腹部剃毛，并用胰岛素注射器(30量规)将4t1细胞(50μl pbs中)注射到乳腺中。每周三次在pbs腹膜内注射拮抗性抗-sirpa抗体(p84)或对照抗体(200μg/注射)，注射4周。
[0606]
结果：如图17所示，与对照抗体相比，抗-sirpa抗体显著(p《0.01)降低了乳腺癌模型中肿瘤的生长。
[0607]
图18显示接种后两周的免疫细胞分析。抗-sirpa对肿瘤和外周(脾)中的骨髓和非骨髓细胞(t细胞和nk细胞)都具有积极作用，其中tregs和记忆t细胞的积累显著减少。
[0608]
实施例21.sirpa抗体对血红蛋白浓度和血细胞比容的影响
[0609]
方法：在第0天和第2天以12mg/kg在c57bl/6小鼠中腹膜内施用抗-sirpa(p84克隆)、抗-cd47(miap410克隆)和无关同种型对照。在第0天和第3天在含有edta的管中收集血液样品，并用xs-800i血液学分析仪(sysmex)进行血细胞计数。在第3天评估血红蛋白水平(左)和血细胞比容的百分比(右)。
[0610]
结果：如图19所示，抗-sirpa抗体对血红蛋白浓度和血细胞比容没有毒性作用。相
反，根据在人的第1阶段观察到的贫血，抗-cd47抗体诱导了血红蛋白浓度和血细胞比容的降低。
[0611]
实施例22.血小板的聚集
[0612]
方法：从健康供体志愿者中将血液收集到用柠檬酸钠缓冲的vacuette收集管(greiner bio-one)中。通过在200g离心10分钟和在3500g离心15分钟分别获得富血小板血浆(prp)和贫血小板血浆(ppp)。将工作prp调整至3
×
108血小板
·
l-1
。抑制测定：将mab与prp预温育至终浓度为40或50μg
·
ml-1
的测试抗体。在不搅拌下3分钟后，加入5μm adp引发血小板聚集。通过使用标准光学聚集计(ta-8v thrombo-aggregometer，sd innovation sas，弗鲁阿尔，法国)在37℃下连续搅拌测量光通过样品的透射率来确定聚集。ppp的透射率设置为100％。在搅拌下记录聚集，共5分钟。诱导测定：通过添加mab(50μg
·
ml-1
)直接引发血小板聚集。在搅拌下记录聚集，共最大10分钟。
[0613]
结果：如图20所示，与抗-cd47抗体相反，抗-sirpa抗体不与人红细胞或血小板结合。因此，抗-cd47诱发体外人血小板的聚集，而抗-sirpa抗体则不诱发。类似地，抗-sirpa抗体不会干扰可逆的adp诱发的人血小板聚集，而抗-整联蛋白α2b则完全消除可逆的adp诱发的人血小板聚集。
[0614]
实施例23.通过来自卵巢癌腹水的sirpa-阻断cd14+细胞增殖同种异体t细胞
[0615]
方法：使用automacs(miltenyi)通过阳性选择从健康志愿者的血沉棕黄层的hpbmc分离同种异体cd4 t细胞。将cd4接种在96孔板(50000细胞/孔)中。用相同的方法从卵巢癌患者的腹水中分离cd14+细胞。将cd14+细胞与同种异体cd4 t细胞以1：1的比例接种5天。在一些条件下，以1：5的比例加入人lps成熟的同种异体单核细胞衍生的树突细胞(modc)以刺激t细胞，并分析从腹水中纯化的不同比例的cd14+mdsc的免疫抑制作用。从增殖试验开始，以饱和浓度(10μg/ml)加入靶向sirpa/cd47途径的抗体。通过在培养的最后12小时内加入h
3-胸苷来测量增殖。
[0616]
结果：如图21a和21b所示，从卵巢癌腹水中纯化的新鲜的和冷冻的人骨髓细胞(tam)是低刺激性同种异体人t淋巴细胞。与抗-cd47抗体相反，抗-sirpa抗体调节骨髓细胞特性，允许人t细胞的活化和增殖。
[0617]
如图21c所示，从卵巢癌腹水中纯化的人骨髓细胞(mdsc)可以抑制由同种异体modc(以1：1和2：1的骨髓细胞对t细胞的比例)诱发的人t细胞增殖。与抗-cd47抗体相反，抗-sirpa抗体不会增强人mdsc诱导的免疫抑制。