一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用与流程

本发明属于分析，具体涉及一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、肺癌早期特征不明显，75％的癌症患者都是在中晚期才确诊。早期肺癌检出率低于25％，但是早期肺癌5年生存率能达到90％以上。

2、目前低剂量螺旋ct(low-dose helical computed tomography，ldct)筛查早期肺癌已经达成共识，但随着ldct筛查的推广，50％接受ldct筛查的人群会检出肺结节。肺结节指肺内直径小于等于30mm的局灶性、类圆形、密度增高的肺部阴影，其中95％肺结节由良性病变引起，包括肉芽肿、淋巴结、慢性炎症、错构瘤等，恶性病变主要包括腺癌、鳞癌等。为实现肺结节的准确诊治，国内外各大临床医学中心制定了一系列诊疗路径和风险预测模型，但目前仍存在18-25％的过度诊断率，尤其是影像学为实性、直径为亚厘米大小的患者术后病理证实为良性疾病的比例高达30％，不仅给患者带来严重的心理负担，也造成国家医疗卫生资源巨大浪费。因此，肺结节良恶性鉴别诊断已成为临床诊治痛点和研究热点，也是健康中国建设和经济发展的重大需求。

3、目前已有多种标志物和技术手段用于肺结节的良恶性鉴别诊断。临床常规应用的血清学肿瘤标志物如：cea、scc、cfra21-1、progrp和nse等对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断具有一定价值，但其单独用于肺结节良恶性鉴别诊断的敏感性和特异性都很低，联合检测在临床i期肺癌检出率不超过20％，远不能满足临床需求；痰脱落细胞学虽然便捷经济、无创，病人接受度高，但敏感性很低，只能对肺癌诊断起提示作用；循环肿瘤细胞(ctc)与肺癌分期有关，对早期肺癌的诊断敏感度达67.2％，但体外ctc检测技术容易受样本量的制约，在早期诊断和筛查中研究较少。

4、越来越多新的证据表明在肿瘤发生发展中，发生在表观遗传层面上的甲基化异常比体细胞突变更为普遍。不同基因dna甲基化与肿瘤类型高度相关，在同一个体具有高度的组织特异性，不同个体的相同组织，其甲基化特征谱也具有较高的一致性。因以dna甲基化为代表的表观遗传修饰往往发生在癌症早期，且与体细胞突变和拷贝数变异相比，具有高度组织特异性，从原理上更适合用于肺结节鉴别诊断标志物研究。

5、循环肿瘤dna(circulating tumor dna，ctdna)作为液体活检中游离dna(cfdna)分子的一种，其携带有肿瘤特异性的遗传及表观遗传学改变。且相较于组织活检，ctdna具有实时、便捷、无创等优点，使其作为新型的肿瘤标志物持续受到关注。越来越多的研究表明，特征性的甲基化"指纹"图谱可用于癌症早期诊断与分期、疗效评估、复发监测和预后判断等。但目前，基于ctdna甲基化的肺结节相关标志物较少，且诊断性能有限。

6、因此，开发基于ctdna甲基化的具有低成本、无创、适合临床推广的肺结节良恶性鉴别的高特异性、高灵敏度的标志物，对肺结节人群的科学管理和有效控制肺癌的发病率，具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中的问题，本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用，通过该筛选方法最终筛选得到78个与肺结节良恶性和/或肺癌鉴别诊断的甲基化标志物，且通过模型构建，评价了本发明提供的甲基化标志物的鉴别诊断性能。该78个甲基化标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性和/或肺癌时，灵敏度高、特异性好，适于肺结节良恶性鉴别诊断的广泛应用。

2、为解决上述问题，本发明首先提供了一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物，所述的甲基化标志物包括以下39个甲基化区域中的任意一个或多个的组合：

3、chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr18：49867019-49867179；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr14：74892573-74892733；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr22：44420459-44420619；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr20：62283562-62283722；chr4：54966998-54967158；chr5：146257858-146258018；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr17：47307472-47307632；chr12：54427101-54427261；chr2：182321922-182322082；chr13：28674645-28674805；chr17：45810438-45810598；chr6：29760212-29760372；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr5：128797252-128797412；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr5：153784739-153784899；chr7：132261297-132261457；chr19：56904958-56905118；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr1：54204130-54204290；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623。

4、优选地，所述的甲基化标志物还包括以下39个甲基化区域中的任意一个或多个的组合：

5、chr19：2290434-2290594；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr7：134143579-134143739；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr14：52781261-52781421；chr6：26204595-26204755；chr19：58951468-58951628；chr5：157098320-157098480；chr14：77228082-77228242；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr6：27100719-27100879；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr6：26189078-26189238；chr4：110224117-110224277；chr15：83316243-83316403；chr14：59104962-59105122；chr11：134146152-134146312；chr6：29716362-29716522；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr14：52734595-52734755；chr11：124735024-124735184；chr20：45338378-45338538；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：151107115-151107275；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267；chr1：29586353-29586513；chr2：43451673-43451833。

6、优选地，所述的甲基化标志物包括以下30个甲基化区域：

7、chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr5：146257858-146258018；chr16：28075032-28075192；chr17：47307472-47307632；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr13：20806316-20806476；chr7：132261297-132261457；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr10：90343107-90343267。

8、优选地，所述的甲基化标志物包括以下42个甲基化区域：

9、chr18：49867019-49867179；chr11：15136199-15136359；chr14：74892573-74892733；chr22：44420459-44420619；chr20：62283562-62283722；chr4：54966998-54967158；chr12：54427101-54427261；chr2：182321922-182322082；chr13：28674645-28674805；chr17：45810438-45810598；chr6：29760212-29760372；chr1：179545118-179545278；chr5：128797252-128797412；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr5：153784739-153784899；chr19：56904958-56905118；chr1：54204130-54204290；chr10：105037463-105037623；chr19：2290434-2290594；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr7：134143579-134143739；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr14：52781261-52781421；chr6：26204595-26204755；chr19：58951468-58951628；chr5：157098320-157098480；chr14：77228082-77228242；chr6：27100719-27100879；chr6：26189078-26189238；chr4：110224117-110224277；chr15：83316243-83316403；chr6：29716362-29716522；chr14：52734595-52734755；chr11：124735024-124735184；chr20：45338378-45338538；chr3：50242683-50242843；chr7：151107115-151107275；chr1：29586353-29586513。

10、优选地，所述的甲基化标志物包括以下45个甲基化区域：

11、chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr4：54966998-54967158；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr7：132261297-132261457；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267；chr2：43451673-43451833。

12、本发明另一方面还提供了前面任一项所述的甲基化标志物在检测肺结节良恶性和/或肺癌检测中的应用。

13、本发明另一方面还提供了一种用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂，所述的试剂用于检测前面任一项所述的甲基化标志物的甲基化水平。

14、本发明另一方面还提供了一种用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂盒，所述的试剂盒包括前面所述的用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂。

15、本发明另一方面还提供了一种前面任一项所述的用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物的筛选方法，包括以下步骤：

16、s1，通过对肺结节和结节旁组织进行rrbs分析，构建本地肺结节甲基化数据集，并根据tcga中illumina 450k luad dna methylation(肺腺癌illumina 450k甲基化芯片)数据集，对两个数据集进行甲基化差异分析，筛选得到恶性肺结节组织特异性的甲基化区域，记为第一筛选dmr；

17、s2，对步骤s1得到的第一筛选dmr进行反向筛选，去除符合以下标准的甲基化区域，得到第二筛选dmr：

18、(1)血细胞和其他器官来源的甲基化区域；

19、(2)靶向检测区域小于4个cpg；

20、(3)血细胞中平均甲基化数值大于0.03的甲基化区域；

21、s3，基于步骤s2得到的第二筛选dmr，通过组织与配对血浆一致的分析、过滤，得到候选甲基化标志物集；

22、s4，将步骤s3得到的候选甲基化标志物集在血浆训练集和测试集中进行机器学习，筛选具有显著差异的甲基化区域，得到用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物。

23、优选地，步骤s1中，所述的第一筛选dmr在两个数据集的甲基化差异分析中满足以下标准：

24、(a)在对照样本的平均甲基化数值小于0.02；

25、(b)在阳性样本与其对照样本的平均甲基化数值比值大于3.0；

26、(c)在阳性样本的平均甲基化数值大于0.05；

27、(d)dmr区域大于20bp；

28、其中，所述的阳性样本为恶性结节组织；所述的对照样本为恶性结节旁组织、良性结节组织和良性结节旁组织。

29、相对于现有技术，本发明的有益效果是：

30、本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别检测的甲基化标志物及其筛选方法和应用，通过该筛选方法最终筛选得到78个与肺结节良恶性和/或肺癌鉴别诊断的甲基化标志物，且通过模型的构建，评价了本发明提供的甲基化标志物的鉴别诊断性能。该78个甲基化标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性和/或肺癌时，灵敏度高、特异性好，适于肺结节良恶性鉴别诊断的广泛应用。