骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用与流程

本发明涉及类器官培养，具体地说，涉及一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。

背景技术：

1、肉瘤是一种多发性恶性肿瘤，约占人类恶性肿瘤的1％。肉瘤生长在来源于胚胎中胚层的间充质组织，如肌肉、脂肪组织和骨骼。根据原代组织的表现，肉瘤可分为两类：第一类为软组织肉瘤，包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、未分化多形性肉瘤(ups)，滑膜肉瘤(ss)和其他小儿肉瘤。第二类为骨肉瘤，包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤(gctb)和尤文肉瘤(es)。临床上，手术通常是肉瘤首选的治疗方法，其次是化疗，用于预防肿瘤转移和复发。尽管有这些治疗手段，肉瘤的临床治疗结果仍然不理想。其中，分子异质性与生物和临床多样性，导致了较差的临床治疗结果。因此，建立可靠的模型以反映肉瘤的分子特征和异质性并用于药物开发和个性化医疗非常重要。

2、传统的体外培养模型的建立需要大量资源，并且需要持续抑制成纤维细胞的生长，该过程不可避免地导致肿瘤在连续传代过程中逐渐丧失分子特征。患者来源的异种移植模型可以保留肿瘤环境的组成部分，但维护成本高，不适合大规模药物筛选。人工类器官系统可以呈现肿瘤表型和分子特征，已经被用于各种类型肿瘤类器官的构建，包括肠道、结直肠、肝、胰腺、前列腺、乳房、膀胱、卵巢和胃肠道肿瘤。然而，多数肿瘤类器官的构建方法利用的是肿瘤组织解离的单细胞，不含免疫或结缔组织元素，并且骨与软组织肉瘤(stbs)的类器官生物库目前尚未建立。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法，包括以下步骤：

3、1)获取骨与软组织肉瘤组织样本，保存在组织保存液中；

4、2)将组织样本从组织保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将组织样本在细胞培养基中切碎，得到组织团块；

5、3)将切碎后的组织样本-细胞培养基悬液一并通过无菌滤网；

6、4)将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器中，加入类器官培养基，混匀；

7、5)加入低吸附培养皿中，放入co2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，培养两周左右，得到骨与软组织肉瘤类器官。

8、步骤1)使用的组织保存液可以是生物防腐培养基“即用型”。

9、步骤2)和3)所述的细胞培养基为含100μg/ml normocin的dmem/f12。

10、步骤4)所述的类器官培养基为含50％ l-wrn细胞培养基、1mm hepes、2mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽、10mm烟酰胺(nicotinamide)、1mm n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine)、2v/v％不含维生素a的b-27、0.5μm a83-01(分子式c25h19n5s)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、292μg/ml l-谷氨酰胺、10nm胃泌素(gastrin)、10μm sb-202190(分子式c20h14fn3o)和50ng/ml人表皮生长因子(egf)的dmem/f12培养基。

11、其中，所述l-wrn细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个l-wrn细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10ml含10％ fbs的dmem/f12培养基，在37℃、5％co2条件下，培养l-wrn细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。

12、进一步地，l-wrn细胞是将r-spondin 3和noggin共表达载体转染到l-wnt3a细胞获得的，该细胞是稳定的商品化细胞系，可以购自atcc。该细胞在培养过程中将wnt3a、r-spondin3和noggin因子分泌到培养基中。此法是获得包含wnt3a、r-spondin3和noggin因子的经典方法。

13、前述的方法，步骤1)所述骨与软组织肉瘤组织来源于人类。

14、前述的方法，步骤1)所述骨与软组织肉瘤类型包括软组织肉瘤和骨肉瘤；

15、软组织肉瘤包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤和滑膜肉瘤等；

16、骨肉瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。

17、前述的方法，步骤2)所述组织团块的体积在0.5mm×0.5mm以下，优选0.1mm×0.1mm。

18、进一步地，步骤2)所述组织团块中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等。

19、前述的方法，步骤4)所述滤网的孔径优选100μm。

20、第二方面，本发明提供按照上述方法制备的骨与软组织肉瘤类器官。

21、所述的骨与软组织肉瘤类器官可进行剪切再培养进行传代。

22、所述的骨与软组织肉瘤类器官可在低温条件下(液氮)长期保存。

23、第三方面，本发明提供按照上述方法制备的骨与软组织肉瘤类器官的以下任一应用：

24、(1)用于药物筛选；

25、(2)用于car-t细胞治疗评估；

26、(3)用于化疗药和靶向药物药敏检测；

27、(4)用于个性化肿瘤疫苗的制备。

28、所述应用包括：将不同种类、浓度、组合的抗肿瘤药物作用于骨与软组织肉瘤类器官，并于一段时间后检测药物对骨与软组织肉瘤类器官的治疗效果、耐药等。

29、具体步骤如下：

30、①当骨与软组织肉瘤类器官用于car-t治疗评估

31、将骨与软组织肉瘤类器官与car-t细胞混合，共同培养。1-7天后测定肿瘤骨与软组织类器官体中肿瘤细胞的存活度、t细胞在类器官中的浸润程度和炎症因子分泌情况，获得car-t细胞治疗效果。

32、②当骨与软组织肉瘤类器官用于化疗药敏检测

33、将制备的骨与软组织肉瘤类器官通过与不同化疗药物种类、药物浓度与药物混合方式进行培养，3-21天后对骨与软组织肉瘤类器官的状态和活性进行考察，排序出最佳的化疗药物方案。

34、③当骨与软组织肉瘤类器官用于靶向药敏检测

35、将制备的骨与软组织肉瘤类肿瘤组织通过与不同药物种类和药物浓度的靶向药进行培养，3-21天后对肉瘤类器官的状态和活性进行考察，排序得出最佳的靶向药药物方案。

36、第四方面，本发明提供一种类器官培养基，其为含50％ l-wrn细胞培养基、1mmhepes、2mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽、10mm烟酰胺、1mm n-乙酰半胱氨酸、2％(v/v)不含维生素a的b-27、0.5μm a83-01、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、292μg/ml l-谷氨酰胺、10nm胃泌素、10μm sb-202190和50ng/ml人表皮生长因子(egf)的dmem/f12培养基。

37、其中，所述l-wrn细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个l-wrn细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10ml含10％ fbs的dmem/f12培养基，在37℃、5％co2条件下，培养l-wrn细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。

38、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

39、(一)本发明采用简单方法获得骨与软组织肉瘤类器官，操作简便，显著提高类器官的存活率和数量，大大缩短类器官培养的时间。并且使用本发明方法得到的骨与软组织肉瘤类器官进行高代次培养时，类器官增殖能力较高，形态良好。

40、(二)相比使用酶解的处理方式，类器官的首次传代时长一般为1-3周，并且获得的肿瘤类器官数量少，用酶解法处理组织的时间比较长，会降低类器官的活力。而本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官数量多，不会破坏类器官的活力。

41、(三)本发明可获得至少八种不同亚型的骨与软组织肉瘤类器官：脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。

42、(四)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官保留了原肿瘤组织块的所有细胞类型，能够更加真实的模拟肿瘤微环境，提供更符合临床的药物敏感测试结果。

43、(五)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行传代和低温储存。

44、(六)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行个性化的car-t治疗评估，化疗药和靶向药的药敏检测。

45、(七)通过骨与软组织肉瘤类器官的药敏实验与临床情况比对，本发明筛选出的药物与得到有效治疗的病患用药相符。本发明可以在未来提供有效的个性化药物选择，免除病患以身试药的痛苦、风险与经济损失。