无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白的改造方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白的改造方法。

背景技术：

1、流感病毒属于正黏病毒科，分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒不仅引起季节性流感感染，还能够通过抗原转换产生新型流感大流行毒株。甲型流感病毒囊膜上的主要糖蛋白血凝素(ha)，负责结合宿主细胞表面受体唾液酸分子，介导病毒侵入宿主细胞。血凝素是研制流感疫苗的主要抗原靶点，血凝素特异性抗体反应的病毒中和效果是评价流感疫苗效力的重要指标。

2、接种疫苗仍是预防流感病毒感染的最经济有效的途径。传统季节性流感疫苗主要通过诱导血凝素头部特异性中和抗体来提供免疫保护作用，疫苗诱导的免疫保护效果往往只对血凝素头部抗原性匹配的流感毒株提供病毒中和作用。但由于流感病毒血凝素头部高度突变，使得传统季节性流感疫苗保护效率不稳定，不同年份的疫苗免疫保护效率变化范围大约为10％至60％。

3、研制广谱流感疫苗是流感疫苗研究的热点研究方向。近年来研究发现血凝素柄部区域氨基酸序列和构象相对头部保守得多，该区域的抗原表位诱导的交叉反应性中和抗体能够较大提升交叉免疫保护范围。大量研究表明通过理性设计改造疫苗免疫原能够有效提高流感疫苗免疫原特异性免疫反应的交叉免疫保护作用。我们于2021年9月提交的专利申请号为cn202111069035.7的发明专利已证实稳定血凝素胞外域三聚体和维持表面天然抗原性能够显著提升交叉免疫保护作用，改造后的血凝素胞外域改造蛋白能够提升与识别跨单体抗原表位的单克隆抗体的结合能力，因此，我们推测交叉免疫保护作用提升与增强的柄部抗体反应有关。成功设计只包含血凝素柄部的免疫原并维持其天然抗原性，将避免头部特异性免疫反应的干扰，集中免疫诱导血凝素柄部特异性抗体反应，增强广谱免疫保护。

4、首先保持可分泌表达的血凝素重组蛋白质的三聚体状态有助于提升蛋白质的天然抗原性。大量研究报道利用外源三聚体基序，例如gcn4、t4 fibritin foldon等，或利用ferritin纳米颗粒结构支架来辅助去头血凝素柄部蛋白质形成三聚体，能够维持部分天然抗原性。相关动物免疫实验结果表明接种优化后的重组血凝素柄部作为疫苗免疫原能够有效诱导特异性免疫反应和交叉免疫保护。但该类疫苗免疫原也会有效诱导外源基序和蛋白质支架的特异性免疫反应，在人体内诱导这些免疫反应可能带来未知风险。如果可分泌表达的去头血凝素柄部蛋白质能够在没有其他外源基序存在的情况下仍能够稳定地形成三聚体并维持整体的天然抗原性，这样的血凝素柄部蛋白质将会是更优化的候选流感疫苗免疫原。基于蛋白质结构分析和设计三聚体界面，引入氨基酸突变促进界面相互作用，将可能实现稳定的三聚体状态。

技术实现思路

1、鉴于目前基于流感病毒血凝素柄部结构域研制广谱流感疫苗免疫原存在的上述不足，本发明提供一种甲型流感病毒血凝素柄部三聚体蛋白质的改造方法，从甲型流感病毒h1n1毒株的血凝素胞外区的氨基酸序列开始理性设计迭代改造血凝素h1柄部蛋白质，通过去除h1头部并在合适位点引入氨基酸点突变从而获得了三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素h1柄部重组蛋白突变体。

2、为了达到上述目的，本发明提供一种无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质的改造方法，具体包括：

3、步骤1：将甲型流感病毒h1的信号肽序列置换成表达系统的信号肽序列，去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列并在其去掉后的缺失空间引入氨基酸交联序列，使用酶切位点和纯化标签替换c端跨膜区和胞内区部分氨基酸序列，再采用氨基酸点突变进行蛋白质界面改造，并依据昆虫细胞宿主优化密码子，利用pfastbac质粒载体多克隆位点将优化改造的h1柄部的编码核酸序列合成在质粒开放阅读框中，获得带有编码甲型流感病毒h1柄部核酸序列的重组质粒；

4、步骤2：利用表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质；

5、其中，所述表达系统包括基因工程改造或驯化的贴壁或悬浮培养的昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统中的任意一种。

6、依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒h1包括与毒株a/new caledonia/20/1999(h1n1)的h1氨基酸序列具有89％以上同源性的h1。

7、依照本发明的一个方面，所述去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列为ha1/x1至ha1/x2的的氨基酸序列；其中，x1位点可以为d35或s36；x2位点可以为c302、p303、k304或l289；所述氨基酸交联序列为3-5个氨基酸组成的短肽，所述短肽中的氨基酸包含g、t、s、p、a中的一种或多种。

8、依照本发明的一个方面，所述酶切位点包括：factor xa切割位点、凝血酶裂解位点、hrv3c蛋白酶切位点、tev蛋白酶切位点、肠激酶切位点、suno蛋白酶切位点中的至少一种；所述纯化标签包括6×his标签、ha标签、flag标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、nusa标签、sumo标签、strep-tag标签中的至少一种。

9、依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒h1柄部的氨基酸点突变的对应突变点包括ha1/r326、ha1/i320、ha1/i323、ha2/f63、ha2/v66、ha2/l73、ha1/l20、ha1/r307、ha2/g1、ha2/g47、ha2/t93、ha2/s124、ha2/n95和ha2/m77。

10、依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒h1柄部的氨基酸点突变包括ha1/r326x3、ha1/i320x4、ha1/i323x5、ha2/f63y、ha2/v66x6、ha2/l73x7、ha1/l20c、ha1/r307c、ha2/g1c、ha2/g47c、ha2/t93c、ha2/s124c、ha2/n95x8、ha2/m77x9；其中，所述x3可以为n或q；所述x4可以为v、n、d或k；所述x5可以为k、r、q或n；所述x6可以为a、i或t；所述x7可以为s、e、d、g或n；所述x8可以为w、i、l、f或a；所述x9可以为f、l、y、i、w或a。

11、依照本发明的一个方面，所述替换c端跨膜区和胞内区氨基酸序列为从ha2/l187至ha2/i222的氨基酸序列；当所述表达系统为昆虫细胞表达系统时，所述表达系统的信号肽序列为mkflvnvalvfmvvyisyiya，所述利用表达系统表达所述重组质粒并纯化具体为：利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质。

12、依照本发明的一个方面，所述利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质的过程具体包括：

13、将带有编码甲型流感病毒h1柄部核酸序列的重组质粒转化到dh10bac宿主菌获得改造bacmid，将bacmid转染静置培养的昆虫细胞sf9制备p1代改造杆状病毒，将0.3ml p1改造杆状病毒加入20ml生长期状态密度为1×106～2×106ml-1的sf9细胞，制备病毒滴度更高的p2代改造杆状病毒，利用p2改造杆状病毒感染较大体积sf9细胞培养物表达h1突变体改造蛋白；

14、收集上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、考马斯亮蓝染色法、western blotfang法检测并确定带有甲型流感病毒血凝素序列的重组质粒的表达情况和三聚体状态，离心上清液后，通过ni-nta树脂亲和纯化法和尺寸排阻色谱法纯化获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质。

15、依照本发明的一个方面，所述无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列包含如seq id 4-8所示；所述无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列还包含如seq id 4-8所示。

16、基于同一发明构思，本发明还公开了上述任一改造方法获得的无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白质，所述蛋白质应用于构建其他融合蛋白质形成三聚体。

17、本发明的有益效果：本发明利用昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统表达重组血凝素蛋白。首先将血凝素分泌信号肽替换为对应表达系统的分泌信号肽；并基于血凝素蛋白质结构分析结果，去掉主要形成血凝素头部区域的氨基酸序列并引入交联序列替换被去掉的头部序列来填补缺失的空间位置；随后使用酶切位点和纯化标签替换h1跨膜区和胞内区的部分氨基酸序列，使得重组蛋白能够分泌表达；再通过引入氨基酸点突变消除融合肽酶切位点、增强重组蛋白质亲水属性、形成二硫键和增强三聚体界面相互作用并能够稳定三聚体结构和重组蛋白质表达产量，最终获得三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素柄部重组蛋白突变体。