一种高效猪α干扰素制备方法及其应用

本发明属于基因工程，特别涉及一种高效猪α干扰素制备方法及其应用。

背景技术：

1、猪的病毒性疾病始终是威胁我国养猪业的重要问题。近年来，非洲猪瘟、猪呼吸繁殖障碍综合征、猪流行性腹泻等病毒不断变异，目前市场上的疫苗无法提供有效的免疫保护，导致猪群出现多种病毒毒株共存，给猪病的预防和治疗造成了的困难。因此，研究和开发新型高效的抗病药物已经成为目前保证养猪行业健康发展的当务之急。

2、干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节功能的细胞因子。由英国科学家issaacs和lindenmenn于1957首次发现。根据基因的组成和蛋白质功能，可以将ifn分为ⅰ型(其中ⅰ型干扰素又包括α,β,∈,κ,ω、δ、τ和ifn-ζ等亚型)、ⅱ型干扰素、ⅲ型，其中ⅰ型干扰素和ⅲ型干扰素在机体控制病毒感染过程中发挥了重要的作用。ifn-α是最重要的ⅰ型干扰素，pifn-α包括又17个亚型。目前pifn-α干扰素具有广谱抗病毒作用，已经在临床上用于多种猪传染性疫病的治疗，但由于现有天然的ifn-α普遍存在副作用大、抗病毒活性低等特点，大大的限制了pifn-α在临床上的应用和推广，因此需要高效低毒的猪ifn-α来应对这一问题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，即解决上述背景技术提出的问题，本发明提出了一种高效猪α干扰素，突变pifn-αs核苷酸序列具有seq no.3所示的dna序列。其所表达的蛋白具有seq idno.4的氨基酸序列所示的氨基酸序列。天然pifn-α序列随机突变，突变后的pifn-αs序列两端加入bamh i和xho i限制性内切酶位点后，送浙江尚亚生物公司进行基因合成，对合成基因的目的片段和pcsmh载体进行双酶切处理，凝胶电泳后采用t4连接酶进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布含amp的lb培养基后，挑取克隆，并提取质粒后，使用bamh i和xho i限制性内切酶进行双酶切鉴定，获得pcsmh-pifn-αs重组表达载体,将含pcsmh-pifn-αs载体的大肠杆菌扩大培养，42℃温度诱导表达，收集菌体进行sds-page蛋白电泳，证明该蛋白为包涵体表达。进一步将表达的蛋白采用ni琼脂糖凝胶过柱子纯化后，western-blot实验检测表达蛋白特异性，结果证明该蛋白具有较好的特异性和反应性。

2、其pifn-αs蛋白用于抑制vsv、prrsv和pedv病毒复制的活性。

3、高效猪pifn-αs蛋白在制备抗pedv新药方面的应用。

4、高效猪pifn-αs蛋白在制备抑制猪相关疫病的新药物方面的应用。

5、本发明的有益技术效果为：首次分析天然猪干扰素(porcine interferonα,pifn-α)的基因序列，通过对猪天然干扰素进行基因突变获得高活性的突变猪干扰素基因序列，其核苷酸显示突变pifn-αs具有seq no.3所示的dna序列。采用原核表达系统对突变的ifn-αs进行表达和纯化，首先构建高效猪pifn-αs的重组表达载体pcsmh-pifn-αs，将载体转化dh5α感受态细胞，进行温度诱导表达后，收集菌体进行sds-page蛋白电泳，证明该蛋白为包涵体表达。进一步将表达的蛋白采用ni琼脂糖凝胶过柱子纯化后，western-blot实验,表明该蛋白具有较好的特异性和反应性。进一步在细胞上检测获得的重组突变pifn-αs对抑制猪水泡性口炎病毒(vsv)、猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(prrsv)和猪流行性腹泻病毒(pedv)的抗病毒活性，结果证明重组突变pifn-αs的抗病毒活性提高了10-20倍，从而为制备治疗猪相关疫病的新药物提供很好的选择。

技术特征：

1.一种高效猪α干扰素，其特征在于：对天然的pifn-α序列进行随机突变，获得的重组突变pifn-αs基因序列，其核苷酸序列显示突变pifn-αs具有seq no.3所示的dna序列。

2.一种权利要求1所述高效猪α干扰素基因编码的蛋白质，其特征在于：其所表达的蛋白具有seq id no.4的氨基酸序列所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述高效猪α干扰素的制备，其特征在于：对天然的pifn-α序列进行随机突变，突变后的pifn-αs序列两端加入bamh i和xho i限制性内切酶位点后进行基因合成，对合成基因的目的片段和pcsmh载体进行双酶切处理，凝胶电泳后采用t4连接酶进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布含amp的lb培养基后，挑取克隆，并提取质粒，使用bamh i和xho i限制性内切酶进行双酶切鉴定，获得重组表达载体pcsmh-pifn-αs,将含pcsmh-pifn-αs载体的大肠杆菌扩大培养，42℃温度诱导表达，收集菌体进行sds-page蛋白电泳，证明该蛋白为包涵体表达,进一步将表达的蛋白采用ni琼脂糖凝胶过柱子纯化后，western-blot实验检测表达蛋白特异性，结果证明该蛋白具有较好的特异性和反应性。

4.一种权利要求1所述高效猪α干扰素的应用，其特征在于：其pifn-αs蛋白用于抑制vsv、prrsv和pedv病毒复制的活性。

5.一种权利要求1所述高效猪α干扰素蛋白在制备抗pedv新药方面的应用。

6.一种权利要求1所述高效猪α干扰素蛋白在制备抑制猪相关疫病的新药物方面的应用。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种高效猪α干扰素制备方法及其应用。首次分析天然猪干扰素(porcineinterferonα,pIFN‑α)的基因序列，通过对猪天然干扰素进行基因突变获得高活性的突变猪干扰素基因序列，其核苷酸显示突变pIFN‑αs具有SEQNo.3所示的DNA序列。采用原核表达系统对突变的IFN‑αs进行表达和纯化，通过western‑blot实验结果表明该蛋白具有较好的特异性和反应性。在细胞上检测获得的重组突变pIFN‑αs对抑制猪水泡性口炎病毒、猪繁殖呼吸障碍综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的抗病毒活性，结果证明重组突变pIFN‑αs的抗病毒活性提高了10‑20倍。

技术研发人员：方剑玉,张青娴,郎利敏,席燕燕,游一,李海利,徐彬,王克领,李绍钰
受保护的技术使用者：河南省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13