一种重离子辐照诱变疯草内生真菌诱变菌种的选育方法

本发明涉及生物，具体涉及一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(u.oxytropis)诱变菌种的选育方法。

背景技术：

1、疯草(locoweed)是含苦马豆素(swainsonine，sw)并可引起动物典型疯草中毒神经症状和病理学变化的棘豆属(oxytropis)和黄芪属(astragalus)有毒植物的统称。动物采食后会引起神经系统疾病“疯草病(localism)”或“绵羊猝狙(peastruck)”。早在1984年，tulsiani d r等首次证明疯草的毒性物质主要是苦马豆素。毒理学研究表明，苦马豆素可抑制哺乳动物细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶ⅱ的活性，引起细胞内低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍，导致细胞空泡变性和组织器官功能紊乱。疯草中内生真菌产生的sw是引起动物中毒病的主要原因，但同时学者发现苦马豆素在一定情况下，可作为有用的治疗药物，其中包括免疫调节剂、肿瘤转移及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等，具有广阔生产前景。

2、目前，苦马豆素纯品因植物提取周期长、效率低和人工合成工艺复杂、纯化难度大等原因，导致苦马豆素价格极其昂贵，严重制约着苦马豆素作为药物的深入研究。重离子束作为一种新的辐射源，具有诱变率高、相对生物效应高、损伤修复效应小及突变不易恢复等优点。

3、本研究以甘肃棘豆中分离鉴定的疯草内生真菌(u.oxytropis)为研究对象，主要通过重离子辐照技术诱变疯草内生真菌(u.oxytropis)，获得稳定的高产sw疯草内生真菌及低产sw疯草内生真菌(u.oxytropis)，达到扩大sw工业化生产目的，为今后通过重离子辐照诱变技术筛选产苦马豆素的疯草内生真菌(u.oxytropis)及其次级代谢产物活性研究提供理论基础。

技术实现思路

1、本发明的目的就是利用重离子束辐照技术筛选出产苦马豆素含量显著提高的的疯草内生真菌(u.oxytropis)的选育方法，提供了一种操作简单、安全、成本低，产苦马豆素含量提高的疯草内生真菌(u.oxytropis)的选育方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(u.oxytropis)诱变菌种的选育方法，包括如下步骤：

3、(1)以疯草内生真菌(alternaria section undifilum oxytropis)为出发菌株，培养，挑取生长良好的菌落，研磨，过滤，得到疯草内生真菌(u.oxytropis)菌种原液；

4、(2)将步骤(1)得到的疯草内生真菌(u.oxytropis)菌种原液用80mev/u的12c6+重离子束辐照进行诱变，辐照剂量为40-140gy，重复两次；

5、(3)将步骤(2)得到的诱变菌株进行接种、培养、研磨，制备成菌悬液，再次培养抽滤、漂洗、烘干并研磨破壁，收集的干粉转移至离心管中，加入甲醇提取，离心，收集上清液，蒸干，复溶，过滤，稀释；得到诱变菌种。

6、优选的，步骤(1)中，菌株的培养是在25℃条件下pda平板上培养30天。

7、优选的，步骤(2)中，重离子辐照使用的是重离子加速器浅层辐照端(hirfl)提供的重离子束12c6+，let为40kev/μm。

8、优选的，步骤(2)中所述重离子的辐照剂量为60gy。

9、优选的，步骤(3)中，培养条件为25℃恒温培养箱中培养15d，所述的再次培养条件为25℃恒温摇床中130r/min培养24d。

10、优选的，步骤(3)中，所述的提取方法为离心管中加入5ml的含0.8％甲酸的甲醇溶液，41℃超声提取90min，3500rpm离心5min，收集上清液。

11、优选的，步骤(3)中，复溶使用的是甲醇溶液。

12、本发明还提供了所述的选育方法制备得到的诱变菌种。

13、本发明还提供了所述的诱变菌种在生产苦马豆素中的应用。

14、本发明的有益效果为：本发明提供了一种疯草内生真菌(u.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，通过重离子辐照诱变方法，成功筛选出与原始菌株相比产sw含量变化显著且稳定的突变菌株，其产sw平均含量为469.64μg/g，较原始菌株平均增加114.01％，相较于现有技术获得了显著的提高，且所述的方法工艺条件简单、安全，成本低、易于工业化生产，为今后通过重离子辐照诱变技术筛选产苦马豆素的疯草内生真菌(u.oxytropis)及其次级代谢产物活性研究提供理论基础，具有广阔的生产和应用前景。

技术特征：

1.一种重离子辐照诱变疯草内生真菌(u.oxytropis)诱变菌种的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，菌株的培养是在25℃条件下pda平板上培养30天。

3.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，重离子辐照使用的是重离子加速器浅层辐照端(hirfl)提供的重离子束12c6+，let为40kev/μm。

4.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中所述重离子的辐照剂量为60gy。

5.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，培养条件为25℃恒温培养箱中培养15d，所述的再次培养条件为25℃恒温摇床中130r/min培养24d。

6.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的提取方法为离心管中加入5ml的含0.8％甲酸的甲醇溶液，41℃超声提取90min，3500rpm离心5min，收集上清液。

7.如权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，复溶使用的是甲醇溶液。

8.如权利要求1-7任一项所述的选育方法制备得到的诱变菌种。

9.如权利要求8所述的诱变菌种在生产苦马豆素中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重离子辐照诱变疯草内生真菌诱变菌种的选育方法，包括如下步骤：(1)以疯草内生真菌为出发菌株，培养，挑取生长良好的菌落，研磨，过滤，得到原液；(2)将步骤(1)得到的菌种原液用80MeV/u的<supgt;12</supgt;C<supgt;6+</supgt;重离子束辐照进行诱变，辐照剂量为40‑140Gy，重复两次；(3)将步骤(2)得到的诱变菌株进行接种、培养，得到诱变菌种；得到的诱变菌种产SW平均含量为469.64μg/g，较原始菌株增加114.01％，且所述的方法工艺条件简单、安全，易于工业化生产，具有广阔的生产和应用前景。

技术研发人员：刘宇,杨珍,郝宝成,莫亚男,王学红,梁剑平,程富胜,张红娟,贺炯杰,崔东安,王玲,尚若锋,王胜义
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13