一种RNA聚合酶β亚单位突变体及应用

：本发明属于基因工程，具体涉及一种rna聚合酶β亚单位突变体及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-fl)和3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)是母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)的重要成分，在调节肠道菌群、免疫力等方面发挥重要作用，具有广阔的市场前景。

2、目前2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的生产方法包括化学合成法、酶合成法、微生物发酵法等，其中微生物发酵法具有环境友好、成本低等优势。大肠杆菌遗传背景清晰、代谢旺盛且增殖迅速，是微生物发酵法中常用的工程菌株。大肠杆菌发酵制备各种母乳低聚糖涉及到多种酶和转运体。其中2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的生物合成路径相似。为提高2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的发酵产率，对二者生物合成路径所涉及的相关基因的编辑手段也相似(huang d,yang kx,liu j,et al.metabolic engineeringof escherichia coli for the production of 2’-fucosyllactose and 3-fucosyllactose through modular pathway enhancement[j].metab eng,2017,41:23-38；徐铮,李娜,陈盈利,等.人乳寡糖2'-fl和3-fl的生物制备研究进展[j].生物工程学报,2020,36(12):12.)。

3、本领域对2'-岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径的关键酶、糖外排转运体等已有深入了解(zhu,y.y.,et al.recent advances on 2'-fucosyllactose:physiological properties,applications,and production approaches.criticalreviews in food science and nutrition,doi:10.1080/10408398.2020.1850413)，并通过对相关酶或转运体编码基因的基因编辑，考察了其对2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖发酵产率的影响。根据报道，敲除以下基因中的一种或多种：β-半乳糖苷酶编码基因lacz、udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj、乳糖lac操纵子序列中的调节基因laci、l-岩藻糖异构酶编码基因fuci、l-墨角藻糖激酶编码基因fuck、l-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶编码基因fuca(ni zj,et al.multi-path optimization for efficient production of 2′-fucosyllactose in an engineered escherichia coli c41(de3)derivative[j].frontiers in bioengineering and biotechnology,2020,8)；和/或过表达以下基因的一种或多种：gdp-岩藻糖合成酶编码基因wcag、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、β-半乳糖苷透性酶编码基因lacy、磷酸甘露糖异构酶编码基因mana、磷酸甘露糖变位酶编码基因manb、糖外排转运体a编码基因seta、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manc、l-阿拉伯糖异构酶编码基因araa、鼠李糖异构酶编码基因rhaa、2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futc、l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化酶编码基因fkp有利于提高2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的发酵产率。其中fuci、fuck、fuca、araa、rhaa、fkp等参与2'-岩藻糖基乳糖的补救合成途径。由于α-(1,3)-岩藻糖基转移酶(futa)的低活性和不溶性表达，与2'-岩藻糖基乳糖相比，3-岩藻糖基乳糖的发酵产率较低。因此，进一步过表达或插入α-(1,3)-岩藻糖基转移酶编码基因futa或对α-(1,3)-岩藻糖基转移酶编码基因futa进行有益突变，更有利于提高3-岩藻糖基乳糖的发酵产率(yun hc,park bs,seo j,et al.biosynthesisof the human milk oligosaccharide 3-fucosyllactose in metabolicallyengineered escherichia coli via the salvage pathway through increasing gipsynthesis andβ-galactosidase modification[j].biotechnology andbioengineering,2019.)。

4、目前，工业生产2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖时，由于发酵环境中高浓度的2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖会对菌株的生产性能造成抑制，因此菌株的环境耐受性对其高效生产来说至关重要。进一步对菌株进行改良，以提高其环境耐受性，进而提高2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产率，仍是目前需要解决的问题。

5、rpoc基因编码大肠杆菌rna聚合酶β亚单位，其突变体可以通过提高部分代谢物产量，引起细胞膜的变化以及增强菌株对特殊代谢物的利用能力，进而增强菌株的环境耐受性。工业生产2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖时，由于发酵环境中高浓度的2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖会对菌株的生产性能造成抑制，因此通过引入rpoc突变体，期望能够提升菌株对发酵环境的耐受性，进而实现2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产量的进一步提升。本发明将通过提供一种rna聚合酶β亚单位突变体以提高菌株耐受性，并将其用于2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的生产。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、为解决上述技术问题，本发明利用基因编辑技术，对大肠杆菌多种酶或转运体的编码基因进行编辑。并通过基因编辑，获得了一种可提高2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产率的rna聚合酶β亚单位突变体并将其应用于2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的生产。

2、本发明提供的技术方案之一，是一种rna聚合酶β亚单位突变体，是在野生型rna聚合酶β亚单位(rpoc，ncbi reference sequences：np_418415.1)的基础上，缺失第215位至第220位的6个氨基酸获得的，具有seq id no.1所示的氨基酸序列。

3、本发明提供的技术方案之二，是上述rna聚合酶β亚单位突变体的应用，特别是在生产2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖中的应用。

4、本发明提供的技术方案之三，是一种生产2'-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，所述工程菌以大肠杆菌k12 mg1655为出发菌株，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的plac启动子序列及调节基因laci和lacz，在原lacz位点之后以ptrc启动子过表达wcag、gmd和lacy基因，进而将乙醇脱氢酶编码基因adhe替换为ptrc启动子过表达的mana和manb，之后敲除基因组上的wcaj基因，将基因组上的rna聚合酶β亚单位基因rpoc突变为seq id no.2所示的rna聚合酶β亚单位突变体基因，并通过质粒pirc99a过表达futc、manc以及seta基因所得。

5、本发明提供的技术方案之四，是一种生产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，所述工程菌以大肠杆菌k12 mg1655为出发菌株，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的plac启动子序列及调节基因laci和lacz，在原lacz位点之后以ptrc启动子过表达wcag、gmd和lacy基因，进而将乙醇脱氢酶编码基因adhe替换为ptrc启动子过表达的mana和manb，之后敲除基因组上的wcaj基因，将基因组上的rna聚合酶β亚单位基因rpoc突变为seq id no.2所示的rna聚合酶β亚单位突变体基因，并通过质粒pirc99a过表达futa、manc以及seta基因所得。

6、进一步地，laci的gene id为945007；lacz的gene id为945006；wcag的gene id为946563；gmd的gene id为946562；lacy的gene id为949083；adhe的gene id为945837；mana的gene id为944840；manb的gene id为946574；wcaj的gene id为946583；manc的gene id为946580；futc的核苷酸序列如seq id no：8所示；seta的gene id为944793；futa基因的核苷酸序列如seq id no：6所示。

7、本发明提供的技术方案之五，是上述生产2'-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的应用，或生产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的应用。

8、有益效果：

9、本发明通过基因编辑技术获得一种rna聚合酶β亚单位突变体，将其应用于生产2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌中，能够大幅提高菌株在发酵时的活细胞数，提高了菌株在发酵罐后期环境中的耐受性，并且2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖产量也大幅度提高。