一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法

本发明涉及一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法，属于生物。

背景技术：

1、熊果酸(ursolic acid,ua)及其同分异构体齐果酸(oleanolic acid,oa)是具有抗癌和抑菌效果的五环三萜化合物。市场对于熊果酸和齐墩果酸的需求量远大于目前采用的植物提取法所能获得的熊果酸和齐墩果酸。并且植物提取法存在耗时长、回收率低以及成本高等问题。通过对合成熊果酸和齐墩果酸的代谢途径进行系统优化，利用微生物细胞工厂生产熊果酸和齐墩果酸成为一种有前途的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种利用微生物细胞工厂生产熊果酸和齐墩果酸的方法，通过引入合成基因为物质生产提供基础，随后通过敲除、强化表达等手段提高熊果酸和齐墩果酸的产量，效果显著优于现有报道。

2、本发明的第一个目的是提供一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的酿酒酵母，所述酿酒酵母表达了香树脂醇合酶crmas、香树脂醇c-28位氧化酶crao和细胞色素-nadph-还原酶atcpr1，敲除了苹果酸合酶mls1，并强化表达了醇脱氢酶adh2、乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1、醛脱氢酶ald6、鲨烯环氧酶erg1以及香树酯醇合酶crmas。

3、进一步地，所述酿酒酵母采用启动子phxt1替换羊毛甾醇合酶erg7的原启动子perg7。

4、进一步地，所述酿酒酵母表达了融合蛋白pln1-crao-atcpr1。

5、进一步地，所述酿酒酵母强化表达了nadh激酶pos5。

6、进一步地，所述酿酒酵母至少增加一个拷贝数的醇脱氢酶adh2、乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1、醛脱氢酶ald6、鲨烯环氧酶erg1、融合蛋白pln1-crao-atcpr1和nadh激酶pos5。

7、进一步地，所述酿酒酵母至少增加两个拷贝数的香树酯醇合酶crmas。

8、进一步地，所述香树脂醇合酶crmas的gene id为jn991165.1，所述香树脂醇c-28位氧化酶crao的gene id为aex07772.1，所述细胞色素-nadph-还原酶atcpr1的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述苹果酸合酶mls1的gene id为855606。

9、进一步地，所述醇脱氢酶adh2的gene id为855349，所述的乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1的gene id为851245，所述的醛脱氢酶ald6的gene id为856044，所述鲨烯环氧酶erg1的gene id为853086，所述nadh激酶pos5的gene id为855913，所述的融合蛋白pln1-crao-atcpr1的核苷酸序列如中seq id no.1所示。本文中所述的gene id均指ncbi平台。

10、进一步地，通过启动子pgal1强化表达醇脱氢酶adh2、香树酯醇合酶crmas以及融合蛋白pln1-crao-atcpr1。

11、进一步地，通过启动子pgal7强化表达乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1、醛脱氢酶ald6以及nadh激酶pos5。

12、进一步地，通过启动子ptef1强化表达鲨烯环氧酶erg1。

13、本发明的第二个目的是提供一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的方法，包括应用上述重组酿酒酵母进行发酵的步骤。

14、进一步地，将所述酿酒酵母在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。

15、进一步地，将酿酒酵母在25～35℃下在种子培养基中活化，得到种子液，将种子液以1-5％的接种量接入发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养。

16、进一步地，所述种子培养基为ypd培养基。

17、进一步地，所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基。

18、本发明的有益效果：

19、本发明公开了一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法。本发明首先通过敲除苹果酸合酶mls1，强化醇脱氢酶adh2、乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1以及醛脱氢酶ald6，增加前体乙酰辅酶a的供应；其次，增加了鲨烯环氧酶erg1以及香树酯醇合酶crmas的拷贝数；随后，采用启动子phxt1替换羊毛甾醇合酶erg7启动子perg7，并进一步表达融合蛋白pln1-crao-atcpr1以及nadh激酶pos5，使得重组酿酒酵母在3-l发酵罐中可以合成1132.9mg/l的熊果酸和433.9mg/l的齐墩果酸。

技术特征：

1.一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达了香树脂醇合酶crmas、香树脂醇c-28位氧化酶crao和细胞色素-nadph-还原酶atcpr1，敲除了苹果酸合酶mls1，并强化表达了醇脱氢酶adh2、乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1、醛脱氢酶ald6、鲨烯环氧酶erg1以及香树酯醇合酶crmas。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母采用启动子phxt1替换羊毛甾醇合酶erg7的原启动子perg7。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达了融合蛋白pln1-crao-atcpr1。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母强化表达了nadh激酶pos5。

5.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母至少增加一个拷贝数的醇脱氢酶adh2、乙酸盐-辅酶a连接酶1acs1、醛脱氢酶ald6、鲨烯环氧酶erg1、融合蛋白pln1-crao-atcpr1和nadh激酶pos5。

6.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母至少增加两个拷贝数的香树酯醇合酶crmas。

7.一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的方法，其特征在于：包括应用权利要求1-6任一项所述的酿酒酵母进行发酵的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将酿酒酵母在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将酿酒酵母在25～35℃下在种子培养基中活化，得到种子液，将种子液以1-5％的接种量接入发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述种子培养基为ypd培养基；所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基。

技术总结
本发明公开了一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法，具体涉及采用重组酿酒酵母进行发酵生产，该重组酿酒酵母至少表达了香树脂醇合酶CrMAS、香树脂醇C‑28位氧化酶CrAO和细胞色素‑NADPH‑还原酶AtCPR1，敲除了苹果酸合酶MLS1，并强化表达了醇脱氢酶ADH2、乙酸盐‑辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1以及香树酯醇合酶CrMAS。

技术研发人员：刘龙,陈坚,石训,吕雪芹,石勇,堵国成,李江华,刘延峰,金柯,党连魁
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12