一种检测呼吸道病毒的半巢式PCR引物组合、试剂盒的制作方法

本发明涉及体外诊断试剂，具体而言，涉及一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合、试剂盒。

背景技术：

1、呼吸道感染是世界范围内人类最常见疾病原因之一，可引发以发热为主的流感症状疾病，是导致儿童死亡的第二大病因。且由于传播途径的特殊性，呼吸道系统病毒感染易在人群中传播。

2、目前对于呼吸道病原体的检测方法有病毒分离培养，免疫学检测和qpcr检测。其中，病毒分离培养虽然诊断特异性为100％，是鉴定病毒的金标准，但是病毒培养时间长且对实验条件要求高，有的病毒培养难度高。免疫检测有酶联免疫吸附实验主要用酶分子标记的抗原或抗体与固定在固相载体上的抗原或抗体发生特异反应，该方法检测快速，对设备要求低，在临床使用广泛，但对操作的规范性要求高，容易造成假阳性。qpcr检测分为taqman探针法和染料法两种，taqman探针法由引物和探针保证特异性，其特异性和灵敏度高，但探针合成价格高；染料法虽然便宜，但是引物自身结构及引物二聚体造成的假阳性偏高。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合、试剂盒以解决目前呼吸道感染的检测技术中存在假阴性特异性不高、检测时间长和价格偏高的问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合，其包括：用于检测乙型流感病毒的第一引物组(gene：influenza b virus,版本号：nc_002210.1)，用于检测呼吸道合胞病毒的第二引物组(gene：human respiratory syncytial virus b，版本号：mh327947.1)，用于检测新型冠状病毒的第三引物组(gene：sars-cov-2，版本号：mn908947)；第一引物组的核苷酸序列如seq id no.1-3所示，第二引物组的核苷酸序列如seq id no.4-6所示，第三引物组的核苷酸序列如seq id no.7-9所示。

4、半巢式pcr与巢式pcr的原理相同，只是在第2轮pcr反应中使用的引物有1条为第1轮pcr的引物，这种利用三条引物进行两次pcr扩增的方法称为半巢式pcr(semi-nestedpcr)。

5、本发明提供了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合，采用上述半巢式pcr引物组合经过两轮pcr反应，可以减少假阴性现象的发生，减少非特异性产物的出现，提高了反应的特异性。具体通过第一轮的pcr，将病毒的目标片段进行初步富集，再经过第二轮的pcr，将病毒的目标片段进一步富集。

6、在本发明应用较佳的实施方式中，第一引物组中如seq id no.1所示的引物序列在5’端标记有荧光基团，第二引物组中如seq id no.4所示的引物序列在5’端标记有荧光基团，第三引物组中如seq id no.7所示的引物序列在5’端标记有荧光基团；

7、在本发明应用较佳的实施方式中，荧光报告基团为hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy5、texas red、ned、alexa flour或vic。

8、在本发明应用较佳的实施方式中，seq id no.1所示的引物序列、seq id no.4所示的引物序列、seq id no.7所示的引物序列在5’端标记的荧光报告基团为fam。

9、第二方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，其包括上述的检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合。

10、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括：pcr mix。pcr mix中包括：dntp混合液、taq dna聚合酶。

11、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照例如选自含乙型流感病毒目的片段的质粒，呼吸道合胞病毒目的片段的质粒及新型冠状病毒目的片段的质粒。

12、阴性对照例如选自正常非呼吸道感染的样本(例如人或其他非人哺乳动物)的基因组dna。

13、在其他实施方式中，上述试剂或试剂盒还包括水。

14、第三方面，本发明还提供了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合在制备检测呼吸道病毒的试剂盒中应用。

15、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒用于：

16、将上述的检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合与待测样本混合；通过半巢式pcr反应，实现乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒的目的片段的扩增，以毛细管电泳实现实现乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒的检测。

17、待测样本包括不限于经过提取的基因组dna，或由反转录形成的cdna。待测样本的来源包括不限于咽拭子、鼻拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、或粪便样本。

18、本发明采用毛细管电泳技术，通过将不同病毒设计成不同长度的目的片段，通过毛细管电泳片段分析技术，根据不同目的片段大小来判断病毒种类，可以实现一管检测多病毒的效果，有助于大幅降低检测成本。

19、在本发明应用较佳的实施方式中，上述半巢式pcr反应包括第一轮半巢式pcr和第二轮半巢式pcr：

20、第一轮半巢式pcr反应体系包括：终浓度均为(0.1-0.4)μm的如seq id no.1-2所示的第一轮半巢式pcr的引物、终浓度均为(0.4-0.8)μm的如seq id no.4-5所示的第一轮半巢式pcr的引物、终浓度均为(0.1-0.3)μm的如seq id no.7-8所示的第一轮半巢式pcr的引物；

21、第二轮半巢式pcr反应体系包括：终浓度均为(0.1-0.4)μm的如seq id no.1和seqid no.3所示的第二轮半巢式pcr的引物、终浓度均为(0.4-0.8)μm的如seq id no.4和seqid no.6所示的第二轮半巢式pcr的引物、终浓度均为(0.1-0.3)μm的如seq id no.7和seqid no.9所示的第二轮半巢式pcr的引物。

22、第一轮半巢式pcr的产物中，乙型流感病毒的pcr产物长度为323bp，呼吸道合胞病毒的pcr产物长度为350bp，新型冠状病毒的pcr产物长度为444bp。

23、第二轮半巢式pcr的产物中，乙型流感病毒的pcr产物长度为297bp，呼吸道合胞病毒的pcr产物长度为331bp，新型冠状病毒的pcr产物长度为428bp。

24、发明人从引物比例调整以及一步法半巢式pcr与两步法半巢式pcr这两个方面对半巢式pcr反应过程进行优化。

25、通过对三种病毒的引物以不同的摩尔比例进行混溶后进行半巢式pcr扩增，根据数据分析结果筛选出：当乙型流感病毒引物终浓度为0.25μm，呼吸道合胞病毒引物终浓度为0.625μm,新型冠状病毒引物终浓度为0.125μm时，能够同时实现乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒的检出。且以阴性对照(正常非感染的基因组dna)为模板，非特异性扩增很少。而当半巢式pcr具有其他体系时，呼吸道合胞病毒未检出，且以阴性对照(正常非感染的基因组dna)为模板，有较多的非特异性扩增，且与目的片段误差在8-10bp，很容易判断错误。

26、通过对一步法半巢式pcr和两步法半巢式pcr两个方案平行实验，结果显示：一步法半巢式pcr会导致呼吸道合胞病毒未检出，新型冠状病毒在目的峰的左侧有非特异性扩增，容易判断错误。因此，两步法半巢式pcr的扩增效果更优。

27、在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一轮半巢式pcr的程序包括：96-99℃，1-5min；96-99℃15s，60℃4min，循环30-35次；72℃1-10min。

28、在本发明应用较佳的实施方式中，上述第二轮半巢式pcr的程序包括：96-99℃，1-5min；96-99℃15s，60℃4min，循环30-35次；72℃1-10min。

29、第四方面，本发明还提供了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合在制备检测呼吸道病毒的芯片中应用。

30、本发明具有以下有益效果：

31、本发明提供了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合，采用上述半巢式pcr引物组合经过两轮pcr反应，可以减少假阴性现象的发生，减少非特异性产物的出现，提高了反应的特异性。

32、此外，还提供了检测呼吸道病毒的试剂盒，采用半巢式pcr引物组合和试剂盒进行检测具有检测特异性高、检测时间短和价格低的技术优势。