一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法

本发明属于基因工程，尤其涉及一种基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法。

背景技术：

1、大豆(glycine max)是世界上最重要的经济作物之一，为人类提供了丰富的植物油、蛋白及其他营养物质。近年来，随着越来越多的饮食与健康、流行病学等调查结果的公布，大豆异黄酮一类豆科植物所特有的次生代谢物，具有抗氧化、抗菌、改善雌激素水平等多方面作用，并已应用于肿瘤、血管系统疾病、免疫调节等疾病的治疗，应用前景广阔。由于种质资源和诱变材料中与大豆异黄酮含量相关的遗传变异有限，很难通过常规育种的方法获得高异黄酮含量的大豆材料，使得高异黄酮大豆品种的培育具有很大困难，研究进展缓慢。

2、大豆异黄酮是一类次生代谢产物，由苯丙烷类/黄酮类代谢途径的一个分支所合成。苯丙氨酸代谢通路在过去的几十年里已经得到了充分研究，由苯丙氨酸解氨酶(pal)、肉桂酸4一羟基化酶(c4h)和香豆酸辅酶a连接酶(4cl)起始，伴随一系列酶促反应转化生成。苯丙氨酸代谢通路中，催化酶基因的表达受转录因子的调控，bhlh(basic helix-loop-helix)转录因子在真核生物中广泛存在，是植物转录因子的第二大家族。bhlh作为转录激活因子或转录抑制因子，参与异黄酮生物合成，在苯丙烷类/黄酮类代谢途径中起着至关重要的作用，它们单独或与其他的转录因子协同作用激活代谢途径中多个关键酶基因的表达，进而调控整个代谢过程。研究发现，拟南芥bhlh-myc类转录因子通过增强抗坏血酸氧化还原循环和黄酮类生物合成，正向调节ja介导的对棉铃虫等害虫的抗性和对氧化应激的耐受性；紫苏的一对等位基因myc-rp和myc-gp的分别异源过表达至烟草和番茄中，导致烟草花的营养组织和番茄花中花青素含量增加；草莓中famyb9、fabhlh3和fattg1结合形成的复合体在苯丙烷类/黄酮类代谢途径中激活了花青素还原酶；苹果mdbhlh3和mdbhlh33与myb转录因子互作，参与调控苹果果实花色苷合成，在低温下，mdbhlh3因磷酸化而增加与结构基因启动子的结合，促进了花色苷的合成。这些研究结果表明，bhlh转录因子对苯丙烷类代谢途径的调控机制有重要作用。在育种中，可通过调节bhlh转录因子的表达，调控大豆中异黄酮的积累，进而培育优异材料。

3、由于种质资源和诱变材料中与大豆异黄酮含量相关的遗传变异有限，很难通过常规育种的方法获得高异黄酮含量的大豆材料，使得高异黄酮大豆品种的培育具有很大困难，研究进展缓慢。迄今为止，利用大豆gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆材料未见报道。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，一种基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，所述方法包括以下步骤：

3、步骤1、构建gmmtb1基因的过表达载体；

4、步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；

5、步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。

6、进一步的技术方案，所述gmmtb1基因获取的具体步骤包括：

7、利用大豆吉林32籽粒不同时期的数字表达谱，筛选到一个与胚的发育协同表达的bhlh转录因子，并以大豆吉林32叶片cdna为模版，克隆得到gmmtb1基因。

8、进一步的技术方案，在所述步骤1中，构建过表达载体的具体步骤包括：

9、以pchf-3300载体为基础，用bamh i和pst i两个酶进行双酶切；再根据gmmtb1的cds序列设计带有限制性内切酶bamh i和pst i的引物序列，经过pcr克隆得到含有酶切位点的gmmtb1序列，将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，pcr鉴定，最终获得gmmtb1基因的过表达载体

10、进一步的技术方案，所述引物序列为：

11、gmmtb1-3300-f：5’-cgcggatccatgaagattgaggtgggg-3’，

12、gmmtb1-3300-r：5’-aaaactgcagtcataatgtctttatggt-3’。

13、进一步的技术方案，所述受体大豆为大豆威廉姆斯82。

14、本发明实施例提供的一种基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，克隆了一个调控苯丙烷代谢通路的关键转录因子gmmtb1，构建pchf3300-gmmtb1过表达载体，通过农杆菌介导法，将pchf3300-gmmtb1过表达载体转入受体大豆威廉姆斯82(w82)中。测定t3、t4代转基因大豆株系和对照植株成熟籽粒中异黄酮含量，在t3、t4代过表达株系中，gmmtb1基因的表达量显著高于对照植株。且在t3、t4代过表达株系成熟籽粒中，异黄酮总含量均显著高于对照植株。证明了过表达gmmtb1基因并转入大豆中，可以获得高异黄酮含量的大豆品系，为高异黄酮含量的大豆品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述gmmtb1基因获取的具体步骤包括：

3.根据权利要求1所述的基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，在所述步骤1中，构建过表达载体的具体步骤包括：

4.根据权利要求3所述的基于过表达gmmtb1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述引物序列为：

5.根据权利要求1所述的基于过表达

技术总结
本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1、构建GmMTB1基因的过表达载体；步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。该方法证明了将过表达GmMTB1基因转入大豆中，可以获得高异黄酮含量的大豆品系，为高异黄酮含量的大豆品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。

技术研发人员：王庆钰,刘添祎,闫帆,杨旭光,刘雅婧,王天亮,王英,李景文,王乐,张鑫生,朱有成,徐子博,赵磊
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12