HA蛋白糖基化修饰模式改变的禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用

本发明属于疫苗，具体涉及一种ha蛋白糖基化修饰模式改变的禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)即可感染家禽、水禽、野禽、野鸟，也能感染多种哺乳动物，包括人类，对家禽养殖业和公共卫生安全带来了双重威胁。目前，多种禽流感病毒亚型可感染人类，其中包括h7n9亚型aiv。此外，h7n9亚型aiv在第五个波次的流行过程中由对家禽表现为低致病性进化为对家禽高致病性的病毒，为h7n9禽流感的防控带来了更大的困难。

2、家禽的疫苗接种对于降低家禽的发病率和死亡率、减少家禽的带毒排毒及降低人群对h7n9病毒的暴露风险有重要意义。目前商品化的h7n9禽流感疫苗为灭活疫苗，在疫病防控上起到了较好的作用。然而，其存在诸多缺陷：(1)依赖于鸡胚进行生产，具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点；(2)只能诱导体液免疫，不能诱导细胞免疫，保护效果不全面；(3)对抗原变异病毒提供的免疫效果有限。因此，需要利用新的技术研发一种更安全高效的h7n9禽流感疫苗，以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。

3、病毒样颗粒(virus-like particle,vlp)是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒，可模拟病毒粒子的天然结构，能全面激活宿主的体液免疫、细胞免疫应答，且免疫持续期更长。而基于杆状病毒-昆虫悬浮细胞表达系统由于其不依赖鸡胚，能保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，被广泛应用于大规模的生产vlp疫苗。因此，基于杆状病毒-昆虫悬浮细胞表达系统生产的流感vlp疫苗具有较大的应用潜力。

技术实现思路

1、糖基化是一种常见的翻译后修饰，在蛋白质生物学功能中起着重要作用。通过改变抗原基序，增加或删除潜在的糖基化修饰，增强疫苗的免疫原性以开发新型疫苗成为了疫苗研究的新手段。

2、目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供ha蛋白糖基化修饰模式改变的禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。

3、技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

4、第一方面，提供一种糖基化修饰模式的ha基因，选自以下任一种：

5、b)ha-38(-)基因：由seq id no：2所示序列或其简并序列编码；

6、c)ha-133(+)基因：由seq id no：3所示序列或其简并序列编码；

7、d)ha-133(+)158(-)基因：由seq id no：4所示序列或其简并序列编码。

8、第二方面，提供上述ha基因的制备方法，其特征在于，包括：

9、根据ha-38(-)基因seq id no：2设计引物，ha-38(-)基因的上游引物序列如seqid no.7所示，ha-38(-)基因的下游引物序列如seq id no.8所示；利用ha-38(-)基因的上游和下游引物序列进行rt-pcr扩增获得ha-38(-)；

10、根据ha-133(+)基因seq id no：3设计引物，ha-133(+)基因的上游引物序列如seqid no.9所示，ha-133(+)基因的下游引物序列如seq id no.10所示；利用ha-133(+)基因的上游和下游引物序列进行rt-pcr扩增获得突变ha-133(+)；

11、根据ha-133(+)158(-)基因seq id no：4设计引物，ha-133(+)158(-)基因的上游引物序列如seq id no.11所示，ha-133(+)158(-)基因的下游引物序列如seq id no.12所示；利用ha-133(+)158(-)基因的上游和下游引物序列进行rt-pcr扩增获得ha-133(+)158(-)。

12、第三方面，提供ha基因重组杆状病毒的制备方法，包括：

13、将扩增后的、ha-38(-)基因、ha-133(+)基因、ha-133(+)158(-)基因分别与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，分别获得ha-38(-)基因重组杆状病毒穿梭质粒、ha-133(+)基因重组杆状病毒穿梭质粒、ha-133(+)158(-)基因重组杆状病毒穿梭质粒；

14、分别用ha-38(-)基因重组杆状病毒穿梭质粒、ha-133(+)基因重组杆状病毒穿梭质粒、ha-133(+)158(-)基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，拯救获得ha基因重组杆状病毒；将成功拯救的ha基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得母本ha基因重组杆状病毒、ha-38(-)基因重组杆状病毒、ha-133(+)基因重组杆状病毒、ha-133(+)158(-)基因重组杆状病毒。

15、第四方面，提供一种重组禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

16、将ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒、m1基因重组杆状病毒按照moi为1：1：1共感染昆虫细胞，其中所述ha基因重组杆状病毒为ha-38(-)基因重组杆状病毒、ha-133(+)基因重组杆状病毒、ha-133(+)158(-)基因重组杆状病毒中的一种或几种混合；

17、培养后收集细胞上清，收获同时含有ha蛋白、na蛋白和m1蛋白的重组的h7n9亚型禽流感病毒样颗粒。

18、进一步地，na基因重组杆状病毒、m1基因重组杆状病毒为分别构建含有h7n9禽流感病毒的na、m1基因的重组杆状病毒穿梭质粒，与杆状病毒dna共同转染昆虫细胞制备而成；具体制备方法参见中国专利cn112079904b。

19、根据a/chicken/guangdong/gd15/2016的na基因设计引物，进行rt-pcr扩增；

20、将扩增后的na基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得na基因重组杆状病毒穿梭质粒；

21、用na基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，拯救获得na基因重组杆状病毒；将成功拯救的na基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得na基因重组杆状病毒；

22、根据a/chicken/guangdong/gd15/2016的m1基因设计引物，进行rt-pcr扩增；

23、将扩增后的m1基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得m1基因重组杆状病毒穿梭质粒；

24、用m1基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，拯救获得m1基因重组杆状病毒；将成功拯救的m1基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得m1基因重组杆状病毒。

25、进一步地，所述重组禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括：

26、步骤一、糖基化修饰模式的ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒、m1基因重组杆状病毒按照moi为1：1：1共感染昆虫细胞，感染72h后收获细胞上清；

27、步骤二、将感染细胞上清液经超滤管5000×g离心浓缩得浓缩液；

28、步骤三、将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖溶液进行纯化，收获40％-50％浓度蔗糖间透明条带，110000×g离心脱糖收获离心后的沉淀液，即得。

29、在一些实施例中，所述昆虫细胞为sf9细胞；杆状病毒dna为优化过的dna，采用proeasytm dna；所述的杆状病毒载体为pvl1393。

30、第五方面，提供一种重组禽流感病毒样颗粒，由上述的制备方法制备得到。

31、本发明制得的ha蛋白糖基化修饰模式改变的禽流感病毒样颗粒，其含有a/chicken/guangdong/gd15/2016(gd15株)的糖基化修饰模式改变的ha蛋白、神经氨酸酶na蛋白和基质m1蛋白；a/chicken/guangdong/gd15/2016(gd15株)的genbank公开序列号为:pb2(ky751288)、pb1(ky751256)、pa(ky751233)、ha(ky751058)、np(ky751157)、na(ky751124)、m(ky751091)、ns(ky751190)。

32、所述的糖基化修饰模式1的ha-38(-)由seq id no：2所示序列或其简并序列编码；所述的糖基化修饰模式2的ha-133(+)由seq id no：3所示序列或其简并序列编码；所述的糖基化修饰模式3的ha-133(+)158(-)由seq id no：4所示序列或其简并序列编码。

33、第六方面，提供一种疫苗，包括药学上可以接受的载体和免疫量的上述的重组禽流感病毒样颗粒。

34、进一步地，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：水包油包水型佐剂；

35、其中所述的水包油包水型佐剂为montanidetmisa系列佐剂，进一步为montanidetmisa 71vg佐剂；疫苗成分比例为禽流感病毒样颗粒：佐剂＝1：2。

36、在一些实施例中，疫苗的制备方法，包括如下步骤：是将基于昆虫杆状病毒悬浮培养系统表达h7n9亚型禽流感病毒的ha/糖基化修饰模式改变的ha、na、m1蛋白的三种重组杆状病毒共感染组装形成的病毒样颗粒与montanidetmisa佐剂混合制备形成；进一步地，该方法包括以下步骤：

37、1.根据a/chicken/guangdong/gd15/2016(gd15株)的糖基化修饰模式1的ha-38(-)(seq id no：2)、糖基化修饰模式2的ha-133(+)(seq id no：3)、糖基化修饰模式3的ha-133(+)158(-)(seq id no：4)设计引物，pcr扩增获取目的基因；

38、2.将目的基因分别与杆状病毒载体pvl1393经双酶切、连接、转化，获得重组杆状病毒穿梭质粒；

39、3.用重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒dna共转染昆虫细胞进行拯救重组杆状病毒，利用pcr、间接免疫荧光试验鉴定重组病毒中目的蛋白的表达；

40、4.将成功拯救的重组杆状病毒转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，并分别鉴定其遗传稳定性；

41、5.将稳定遗传且序列无突变的三种重组杆状病毒按照moi为1：1：1共感染sf9昆虫细胞，72h后离心收上清，电镜观察鉴定；

42、6.将感染上清液经超滤管5000xg离心浓缩；将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖纯化，收获40％-50％浓度间透明条带，110000xg离心脱糖收获沉淀液，利用bca测定蛋白浓度；

43、7.将收获的病毒样颗粒以免疫剂量与佐剂1：2混合乳化，制备疫苗。

44、第七方面，提供所述的重组禽流感病毒样颗粒或权利要求9所述的疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。其中，禽流感病毒包括h7n9亚型禽流感病毒。

45、将制备的疫苗免疫spf鸡，一次免疫三周内分别采血检测抗体效价。免疫三周后以致死剂量的h7n9高致病性禽流感病毒攻击，观察死亡并检测排毒。

46、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

47、(1)本发明表明，当vlp疫苗ha蛋白的第38、133和158位同时发生糖基化修饰时，效果最佳，体现在：显著增加抗原产量、显著提升vlp疫苗诱导的体液免疫、显著减轻spf鸡的排毒和肺损伤。

48、(2)本发明表明，通过单独表达ha/糖基化修饰模式改变的ha、na和m1蛋白的重组杆状病毒共感染sf9细胞可成功组装h7n9 vlp，且vlp疫苗能够诱导产生较强的抗体免疫应答，能够提供针对h7n9病毒攻击完全的临床保护且显著抑制排毒。

49、(3)该发明制备的ha蛋白糖基化修饰模式改变的禽流感病毒样颗粒疫苗为h7n9禽流感的防控提供了新的疫苗选择，为研制其他新型病毒样颗粒疫苗奠定了基础，并由于其操作简单、免疫效力强、安全性高等优势，具有很大的实际应用潜力。