一种用于防治疱疹病毒感染的胎盘源细胞因子制备方法及其制剂的应用与流程

本发明涉及一种用于防治疱疹病毒感染的胎盘源细胞因子制备方法及其制剂的应用。

背景技术：

1、人类疱疹病毒（human herpes virus，hhv）感染非常普遍，在发达国家，其感染率为40~60%，而在发展落后的国家，常人感染率可达100%。在我国，儿童感染率为80%左右。hhv为弱致病因子，正常人一般为潜伏感染或无症状的亚临床感染，但对机体免疫力低下（如婴幼儿、老年人）、免疫抑制或缺陷的病人来说原发感染或潜伏感染的hhv可激活引起活动性hhv感染，导致各种常见疾病，并加重一些免疫力低下的患者原有疾病的症状，甚至引起死亡。

2、过去四、五十年至今，由于器官移植、肿瘤患者、艾滋病患者的大量增加，使hhv 感染更为普遍，hhv感染致死率明显上升，同时，hhv也是先天性感染最常见的病因之一。

3、常见的人疱疹病毒主要有8种，其中人是单纯疱疹病毒（hsv）和巨细胞病毒（hcmv）唯一的宿主。

4、目前，疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织，感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，严重威胁人类健康。与疱疹病毒感染相关的疾病有以下几种：1)原发性高血压患者存在较高的活动性疱疹病毒感染；2)疱疹病毒感染导致细胞内皮受损从而参与了冠心病的发病过程；3)肺部感染性疾病合并疱疹病毒感染；4) 慢性乙型肝炎合并疱疹病毒感染，可加重肝功能障碍；5)肾功能衰竭透析患者疱疹病毒感染率明显升高；6)烧伤后人疱疹病毒感染率显著升高，尤其以大面积烧伤患者更甚；7)其它接受免疫抑制剂疗法的患者合并人类疱疹病毒感染，其中以恶性肿瘤接受化疗合并疱疹病毒感染最为常见。

5、此外，hhv还与横断性脊髓炎、多神经根炎、guillain-barre综合征、心肌炎、血小板减少症、溶血性贫血、各类血细胞减少、继发性硬化性胆管炎、静脉血栓形成、joubert's综合征、糖尿病、系统性红斑狼疮、肾病综合征、meniere's病、类风湿关节炎、慢性牙周炎等有关。

6、 hhv感染在临床致病中正不断得到新认识，越来越多的人体疾病都被认为与它的感染有关。针对疱疹病毒感染，目前尚缺乏有效的治疗措施，临床上抗疱疹病毒常用药物有阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、干扰素、免疫球蛋白以及单克隆抗体等，但这些药物都不能进行针对性的有效治疗，病毒仍然很容易复发，而且也容易产生耐药性。

7、目前临床上阿昔洛韦和更昔洛韦是治疗hhv感染的首选药物，主要通过抑制dna多聚酶而发挥抗病毒作用。临床上阿昔洛韦和更昔洛韦对hhv感染的视网膜炎有确定疗效，但对hhv感染的间质性肺炎疗效不明显，且其毒性较大，某些患者因严重的副作用，如粒细胞减少而被迫中断治疗。此外，近年来，hhv对阿昔洛韦和更昔洛韦的耐药株有渐多趋势，研究发现，耐药株常有ul97区的取代或缺失等突变，加上阿昔洛韦和更昔洛韦价格昂贵，这些不可克服的缺点，使其在临床的应用受到很大的限制。而其它的抗hhv感染的药物，如磷甲酸钠、西多福韦，也存在类似的问题。因此，寻找和研究疗效确切的抗hhv感染药物以及治疗和预防hhv感染所致疾病的药物具有重要的创新意义和临床价值。

8、本发明涉及采用胶原酶ⅰ、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶三联酶，通过调整酶的组成、ph值、温度和时间，进行分级解离胎盘组织，收集胎盘组织解离液，用交联葡聚糖sephadex凝胶柱分离胎盘组织解离液中的活性物质，获得多种必需的氨基酸、小分子活性肽、免疫球蛋白、脂多糖等；同时从胎盘组织解离液中贴壁收集原代胎盘源间充质干细胞，通过体外增殖培养，诱导间充质干细胞高表达活性因子，主要为白细胞介素（il）、集落刺激因子（csf）、肿瘤坏死因子（tnf）、干扰素（ifn）、表皮生长因子（egf）、转化生长因子（tgf）等，合并收集，我们将它们称为胎盘源细胞因子。将胎盘源细胞因子冻干制备成样品和制剂，通过体外和体内抗人疱疹病毒活性筛选实验研究获得新的发现，胎盘源细胞因子可显著抑制人疱疹病毒导致helff细胞和小鼠睾丸病变的发生，具有较强的抗人疱疹病毒感染作用，尤其对耐药株感染者。而且毒性试验结果显示，口服给予最大耐受量胎盘源细胞因子未见动物出现毒性反应。这与目前临床上应用的抗人疱疹病毒感染药物阿昔洛韦和更昔洛韦相比，胎盘源细胞因子具有抗疱疹病毒感染的效果更明显、安全性更好、成本更低的优点，因此，胎盘源细胞因子在抗人疱疹病毒感染的作用上将具有良好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于防治疱疹病毒感染的胎盘源细胞因子制备方法及其制剂的应用。即采用三联酶分级法解离胎盘组织，收集胎盘组织解离液，用交联葡聚糖sephadex凝胶柱分离胎盘组织解离液中的活性物质，获得多种必需的氨基酸、小分子活性肽、免疫球蛋白、脂多糖等；从胎盘组织解离液中贴壁收集原代胎盘源间充质干细胞，通过体外增殖培养，诱导间充质干细胞高表达活性因子，即白细胞介素（il）、集落刺激因子（csf）、肿瘤坏死因子（tnf）、干扰素（ifn）、表皮生长因子（egf）、转化生长因子（tgf）等，合并收集，我们将它们称为胎盘源细胞因子。将胎盘源细胞因子冻干并制备成药品、保健品、食品和/或外用制剂及组织保存液等，通过体外helff细胞感染疱疹病毒试验、小鼠睾丸感染单纯疱疹病毒试验和临床疱疹病毒感染患者的抗杀疱疹病毒作用，活性测定结果显示，从胎盘组织提取活性细胞因子合并胎盘源间充质干细胞制备得到的胎盘源细胞因子，可显著抑制疱疹病毒导致helff细胞和小鼠睾丸的病变发生，修复疱疹病毒感染导致helff细胞坏死和小鼠睾丸组织损伤，并且临床应用上也表现较强的抗杀单纯疱疹病毒作用，尤其对耐药株感染者，与目前临床上应用的抗杀疱疹病毒感染药物阿昔洛韦和更昔洛韦相比，胎盘源细胞因子抑制单纯疱疹病毒感染的发展其效果更显著。而且，毒性试验结果表明，小鼠灌胃给予胎盘源细胞因子的ld50>1.8g/kg；小鼠最大耐受量为人口服剂量的400倍，未见动物死亡。

2、为了更好地理解本发明的实质，下面具体介绍：1）三联酶分级法解离胎盘组织；2）交联葡聚糖sephadex凝胶柱分离胎盘组织解离液中的活性物质；3）贴壁收集原代胎盘源间充质干细胞及体外增殖培养，诱导间充质干细胞高表达活性因子；4）胎盘源细胞因子抗人疱疹病毒感染的药理、药效试验及其安全性试验，5）以及制剂制备试验。

技术特征：

1.一种用于防治疱疹病毒感染的胎盘源细胞因子制备方法及其制剂的应用。

2.根据权利要求1的用途，胎盘源细胞因子系从胎盘组织提取具有活性的细胞因子，合并通过体外增殖的胎盘源间充质干细胞获得，其特征在于：每0.5 kg新鲜的胎盘组织制备得每10 g~30 g胎盘源细胞因子，其中含有白细胞介素（il）0.5 g~1.5 g、集落刺激因子（csf）0.1 g~1.0 g、肿瘤坏死因子（tnf）0.1 g~1.0 g、干扰素（ifn）0.5 g~1.5 g、表皮生长因子（egf）0.5 g~1.5 g、转化生长因子（tgf）0.1 g~1.0 g，以及多种必需的氨基酸1.0 g~5.0 g、小分子活性肽1.0 g~5.0 g、免疫球蛋白0.5 g~1.5 g、脂多糖1.0 g~5.0 g等。

3.根据权利要求1、2的用途，其特征在于：采用三联酶分级法解离胎盘组织，收集胎盘组织解离液，用交联葡聚糖sephadex凝胶柱分离胎盘组织解离液中的活性物质，主要获得多种必需的氨基酸、小分子活性肽、免疫球蛋白、脂多糖等；从胎盘组织解离液中贴壁收集原代胎盘源间充质干细胞，通过体外增殖培养，诱导间充质干细胞高表达活性因子，主要为白细胞介素（il）、集落刺激因子（csf）、肿瘤坏死因子（tnf）、干扰素（ifn）、表皮生长因子（egf）、转化生长因子（tgf）等。

4.根据权利要求3的用途，其特征在于：所述的三联酶为0.03%~0.3%胶原酶ⅰ、0.05%~0.5%胰蛋白酶、0.1%~0.5%木瓜蛋白酶；所述的分级法系1）酶解分级，先用胶原酶ⅰ，再用胰蛋白酶，最后胰蛋白酶和木瓜蛋白酶联用；2）ph值分级，ph值7.0~7.6，ph值7.4~8.0，ph值7.0~6.5；3）温度和时间分级，2~8℃放置6~48h，30~40℃放置0.5~48小时，45~60℃，放置2~6小时。

5.根据权利要求3、4的用途，其特征在于：0.03%~0.3%胶原酶ⅰ在ph值7.0~7.6，37℃培养4-48h，无需震荡，避免ph值低于6.5；05%~0.5%胰蛋白酶在ph值7.4~8.0，先于2~8℃放置6~48h，再于37℃培养0.5-2h；0.1%~0.5%木瓜蛋白酶ph值7.0~6.5，45~60℃放置2~6小时。

6.根据权利要求3的用途，其特征在于：所述的用交联葡聚糖sephadex凝胶柱为sephadex g-25、sephadex g-50、sephadex g-75，分离蛋白、多肽、小分子肽、氨基酸及其他小分子等活性物质。

7.根据权利要求1的用途，其特征在于：所述的疱疹病毒为单纯疱疹病毒（hsv）和人巨细胞病毒（cmv）等；疱疹病毒感染及其相关疾病系指病毒经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等途径侵入机体，出现粘膜或皮肤局部集聚的疱疹、溃疡、炎症，常见的如龈口炎、唇疱疹、湿疹样疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎等，炎症严重者伴有高热身痛，偶尔发生严重的全身性疾病，累及内脏。

8.根据权利要求1的用途，其特征在于：所述的制剂应用为药品、保健品、食品以及外用制剂、组织保存液等。

技术总结
本发明公开了一种用于防治疱疹病毒感染的胎盘源细胞因子制备方法及其制剂的应用。具体地说，本发明涉及采用胶原酶Ⅰ、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶三联酶，通过调整酶的组成、PH值、温度和时间，进行分级解离胎盘组织，收集胎盘组织解离液，用交联葡聚糖Sephadex凝胶柱分离胎盘组织解离液中的活性物质，获得多种必需的氨基酸、小分子活性肽、免疫球蛋白、脂多糖等；同时从胎盘组织解离液中贴壁收集原代胎盘源间充质干细胞，通过体外增殖培养，诱导间充质干细胞高表达活性因子，主要为白细胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）等，合并收集，我们将它们称为胎盘源细胞因子。将胎盘源细胞因子冻干制备成样品和制剂，通过体外HELFF细胞感染疱疹病毒试验、小鼠睾丸感染单纯疱疹病毒试验和临床疱疹病毒感染患者的抗杀疱疹病毒作用，活性测定结果显示，从胎盘组织提取活性细胞因子合并胎盘源间充质干细胞制备得到的胎盘源细胞因子，可显著抑制疱疹病毒导致HELFF细胞和小鼠睾丸的病变发生，修复疱疹病毒感染导致HELFF细胞坏死和小鼠睾丸组织损伤，并且临床应用上也表现较强的抗杀单纯疱疹病毒作用，尤其对耐药株感染者。

技术研发人员：刘建玲,蓝苑元,黄菊萍,李京
受保护的技术使用者：广西桂科院康脉生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16