一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其制备、检测方法与流程

本发明涉及免疫学测定，尤其涉及一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其制备、检测方法。

背景技术：

1、低密度脂蛋白(ldl)具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成。一般将ldl亚组份中颗粒较小、密度较大的ldl称为“小而密ldl(smalldense low-densitylipoprotein，sdldl)”；将颗粒较大、密度较小的ldl称为“大而轻ldl”；介于二者之间的亚组份称为“中密度ldl”。

2、近来研究发现，与普通ldl相比，sdldl致动脉粥样硬化的能力更强，是公认的引发心血管病的重要危险因素之一，且已被美国胆固醇教育计划(nationalcholesteroleducation program，ncep)委员会成人治疗组列入新发现的重要心血管病危险因素之一。

3、目前，在临床检测应用中，测定sdldl的方法有电泳法、超速离心法和分级沉淀法等。但这些方法检测时间很长，不能进行大规模自动化检测，且需要昂贵的仪器设备，故不能应用于一般的临床医学检测。近几年来出现了采用表面活性剂和磷脂酶清除试样中非小而密脂蛋白胆固醇，但该类方法采用磷脂酶，价格昂贵。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种线性范围宽、检测速度快、灵敏度高、特异性好，且因无需磷脂酶而成本低廉的小而密脂蛋白胆固醇(sd-ldl)测定试剂盒及其制备、检测方法。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；

4、所述试剂r1包括：缓冲液30～50mmol/l，表面活性剂a 0.1～1％，表面活性剂b0.4～1.0％，离子化合物10～20g/l，胆固醇酯酶2～4ku/l，胆固醇氧化酶2～4ku/l，过氧化氢酶75～95ku/l，稳定剂10～25g/l，防腐剂0.01～0.5％；

5、所述试剂r2包括：缓冲液30～50mmol/l，表面活性剂c 0.1～0.2％，离子化合物10～20g/l，toos 2.0～3.0mmol/l，过氧化物酶2.5～4ku/l，4-氨基安替比林2～3mmol/l，稳定剂0.2～5g/l，防腐剂0.01～0.3％。

6、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1中的缓冲液为mops缓冲液或mopso缓冲，ph为6～7；试剂r2中的缓冲液为mops缓冲液或mops缓冲液，ph为7～8。

7、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、蔗糖中的一种或多种。

8、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的防腐剂为叠氮钠、proclin-300中的一种或多种。

9、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的离子化合物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾中的一种或多种。

10、作为本发明的优选方式之一，所述表面活性剂a为genapol。

11、作为本发明的优选方式之一，所述表面活性剂b为thesit。

12、作为本发明的优选方式之一，所述表面活性剂c为b66。

13、一种上述小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

14、(1)配制试剂r1：

15、将所述表面活性剂a、表面活性剂b、离子化合物加入缓冲液中，搅拌至完全溶解，然后加入胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、稳定剂、防腐剂，即得试剂r1；

16、(2)配制试剂r2：

17、将所述表面活性剂c、离子化合物、toos加入缓冲液中，搅拌至完全溶解，然后加入过氧化物酶、4-氨基安替比林、稳定剂、防腐剂，即得试剂r2。

18、一种上述小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

19、(1)吸取3μl样本，加入150μl试剂r1，37℃孵育3～5min；

20、(2)再加入50μl试剂r2，置于37℃孵育；

21、(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于600nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；

22、(4)按照△a＝a2-a1来计算吸光度变化值δa，并根据δa对照标准曲线计算出样本中sd-ldl含量。

23、本发明sd-ldl测定试剂盒，基于trinder反应比色法，其原理是：采用试剂r1的表面活性剂a、表面活性剂b将所测试的小而密脂蛋白胆固醇包裹，清除非小而密脂蛋白胆固醇；随后加入试剂r2，释放小而密脂蛋白胆固醇；根据trinder反应吸光度增加量，即可在特定波长处测定颜色变化，定量检测血清中的sd-ldl含量。

24、其中，试剂r1中：离子化合物通过电荷作用对脂蛋白进行分散，以使表面活性剂a、表面活性剂b与胆固醇酯酶等选择性地作用于特定脂蛋白，从而达到测量特定脂蛋白中胆固醇的量；表面活性剂a与表面活性剂b之间作用形成交联网状结构，将小而密脂蛋白胆固醇包裹，并在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶作用下，排除非小而密脂蛋白胆固醇的干扰。

25、试剂r2中：表面活性剂c与表面活性剂a、b作用，释放小而密脂蛋白胆固醇。

26、本发明相比现有技术的优点在于：

27、(1)本发明试剂无需使用磷脂酶，配制简单，成本低，能够高效、准确地定量试样中sdldl；

28、(2)本发明试剂盒工艺简单、线性范围宽、检测速度快、灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好；

29、(3)本发明直接消除法，可以有效排除小而密之外所有脂类干扰，由于其适用性强、测试方便等特性，已广泛应用于临床检测中；

30、(4)本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中sd-ldl的含量，直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率。

技术特征：

1.一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，包括试剂r1和试剂r2；

2.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1中的缓冲液为mops缓冲液或mopso缓冲，ph为6～7；试剂r2中的缓冲液为mops缓冲液或mops缓冲液，ph为7～8。

3.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2中的稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、蔗糖中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2中的防腐剂为叠氮钠、proclin-300中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2中的离子化合物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂a为genapol。

7.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂b为thesit。

8.根据权利要求1所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂c为b66。

9.一种如权利要求1～8任一所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.一种如权利要求1～8任一所述的小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括缓冲液、表面活性剂A、表面活性剂B、离子化合物、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、稳定剂、防腐剂；试剂R2包括缓冲液、表面活性剂C、离子化合物、Toos、过氧化物酶、4‑氨基安替比林、稳定剂、防腐剂。本发明还提供了一种小而密脂蛋白胆固醇测定试剂盒的制备、检测方法。本发明的优点在于：线性范围宽、检测速度快、灵敏度高、特异性好，且因无需磷脂酶而成本低廉。

技术研发人员：芮双印,王海银
受保护的技术使用者：安徽大千生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13