重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及重组car元件及其在her2阳性肿瘤中的应用。

背景技术：

1、近年来细胞免疫治疗势如破竹，迄今为止已有多种嵌合受体t细胞(chimericantigen receptor t-cell，car-t)治疗产品获得美国食品药物管理局批准上市。而嵌合抗原受体(car)免疫细胞治疗淋巴母细胞白血病和b淋巴瘤的成功，促进了更多针对cd19以外的特定肿瘤抗原的car产品的发展。在这些car候选细胞中，anti-her2 car细胞(her2-car)是市场应用最成熟的细胞，其中的原癌基因：人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowth factor receptor-2，her2)基因，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185kd的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。大量研究表明，her2基因的过表达与多种人类恶性肿瘤相关，是目前公认的肿瘤相关抗原，并且已经应用于肿瘤治疗20多年。

2、但目前嵌合受体t细胞疗法仍主要用于血液系统恶性肿瘤的治疗。这主要是因为实体瘤自身致密的细胞和基质屏障，使得car-t细胞难以进入肿瘤内部而极大限制了其疗效的发挥。研究表明，髓系来源的单核/巨噬细胞可以穿透肿瘤周围致密基质组织，并在瘤内富集。并且巨噬细胞在直接杀伤肿瘤的同时，又能通过抗原呈递增强适应性免疫应答，这些特点使巨噬细胞成为抗肿瘤细胞疗法开发的独特选择。尝试将髓系来源的单核/巨噬细胞作为car蛋白的宿主，开发针对实体瘤的嵌合受体免疫疗法具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组car元件及其在her2阳性肿瘤中的应用。本发明提供的靶向her2的重组car元件，能够使单核/巨噬细胞杀伤肿瘤细胞。

2、本发明提供了一个靶向her2基因的car元件，其结构包括特异性her2抗体的单链可变区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

3、所述胞外铰链区为cd8a铰链区；

4、所述胞内信号域为cd3ζ胞内段和cd147胞内段。

5、进一步的，所述car元件自n端至c端依次为：

6、her2抗体轻链fab端-linker-her2抗体重链fab端-cd8a铰链区-跨膜区域-cd3ζ胞内段-cd147胞内段。

7、本发明提供的car元件能够靶向her2基因，同时增加的cd147胞内段，使其在促adcp的同时促进car-单核细胞的mmps分泌，从而降解肿瘤基质，协助t细胞瘤内浸润。相比于其他结构的car元件，本发明所述的car元件能够更有效杀伤肿瘤细胞，且具有安全性，能够可持续性供应。

8、本发明提供的所述car元件，具体的，

9、所述her2抗体轻链fab端的氨基酸序列如seq id no:1所示；

10、所述linker(g4s1)3的氨基酸序列如seq id no:2所示；

11、所述her2抗体重链fab端的氨基酸序列如seq id no:3所示；

12、所述cd8a铰链区的氨基酸序列如seq id no:4所示；

13、所述跨膜区域的氨基酸序列如seq id no:5所示；

14、所述cd3ζ胞内段的氨基酸序列如seq id no:6所示；

15、所述cd147胞内段的氨基酸序列如seq id no:7所示。

16、本发明所述的car元件，其全长氨基酸序列为：

17、diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycyekrrkpedvlddddagsaplkssgqhqndkgknvrqrnssrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

18、本发明提供了编码所述car元件的核酸。具体的，

19、编码所述her2抗体轻链fab端的核酸序列如seq id no:9所示；

20、编码所述linker(g4s1)3的核酸序列如seq id no:10所示；

21、编码所述her2抗体重链fab端的核酸序列如seq id no:11所示；

22、编码所述cd8a铰链区的核酸序列如seq id no:12所示；

23、编码所述跨膜区域的核酸序列如seq id no:13所示；

24、编码所述cd3ζ胞内段的核酸序列如seq id no:14所示；

25、编码所述cd147胞内段的核酸序列如seq id no:15所示。

26、本发明所述的car元件，其全长核酸序列为：

27、gacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcaggacgttaacaccgctgttgcttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaactgctgatctactctgcttctttcctgtactctggtgttccgtctcgtttctctggttctcgttctggtaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagcactacaccaccccgccgaccttcggtcagggtaccaaagttgaaatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaacatcaaagacacctacatccactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcgtatctacccgaccaacggttacacccgttacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctgctgacacctctaaaaacaccgcttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgctctcgttggggtggtgacggtttctacgctatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttctaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgctacgagaagcgccggaagcccgaggacgtcctggatgatgacgacgccggctctgcacccctgaagagcagcgggcagcaccagaatgacaaaggcaagaacgtccgccagaggaactcttccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

28、本发明中，所述的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本发明实施例中，所述核酸为dna形式。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述rna形式为由基因转录获得的mrna等。

29、本发明提供了所述car元件的包装载体，其包括骨架载体和所述的car元件。

30、本发明所述的包装载体，能够将核酸或者蛋白包被起来，传递至培养的细胞或者人体内，具有递送遗传物质的功能，其可以是病毒载体也可以是质粒载体，其中病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒；质粒载体包括原核载体和真核载体。在本发明的实施例中，选择慢病毒载体构建car元件的包装载体，再用hek-293ft细胞包装慢病毒。一些具体实施方式中，所述慢病毒载体为pcdh。

31、icaspse9基因能够诱发细胞的自杀机制，防止thp-1无限生长，彻底清除治疗后体内残留的thp1，避免产生不必要的毒副作用。本发明将icaspse9基因引入靶向her2基因的car-免疫细胞的构建。本发明中，所述icaspse9的氨基酸序列如seq id no:8所示。所述icaspse9基因的核酸序列如seq idno:16所示。

32、一些实施方式中，icaspse9基因位于所述car元件的包装载体中。即，所述car元件的包装载体中还包括icaspse9基因。

33、另一些实施例中，icaspse9基因位于另一个的质粒中，与所述car元件的包装载体组成质粒组合。所述icaspse9质粒包括依次连接的icaspse9片段基因、linker和报告基因。

34、本发明所述的质粒组合中，包括两个质粒，分别为car质粒：pcdh-ef1a-her2抗体轻链fab端-linker(g4s1)3-her2抗体重链fab端-cd8a铰链区-跨膜区域-cd3ζ胞内段-cd147胞内段，和icaspse9质粒：pcdh-ef1a-icaspse9-furin p2a-zsgreen。

35、本发明所述质粒组合还包括慢病毒转染辅助质粒。所述慢病毒转染辅助质粒分别包含不同的元件，能够提高病毒在体内的安全性。在本发明的实施例中，所述慢病毒转染辅助质粒为商品化慢病毒包装质粒，其包括但不限于plp1、plp2和plp-vsvg。

36、本发明提供了转化或转染如前所述car元件、包装载体或质粒组合的宿主。所述为免疫细胞或原核细胞。本发明中，所述原核细胞用于编码car元件核酸的保存和扩增。所述免疫细胞用于制备治疗肿瘤的药物。本发明中，所述免疫细胞选自为t细胞、nk细胞、髓系来源的单核或巨噬细胞。

37、本发明所述的表达宿主，能够在体内稳定表达外源dna，其包括动物细胞、植物细胞、微生物细胞、细菌和酵母。在本发明的实施例中，选择髓系来源的单核或巨噬细胞作为car元件、包装载体或质粒组合的表达宿主。一些具体实施例中，所述髓系来源的单核或巨噬细胞为人类髓系来源的单核或巨噬细胞。

38、本发明中，car元件、包装载体或质粒组合转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。在一些具体的实施例中，本发明通过病毒转染方式进行所述宿主的构建。

39、本发明提供的car元件、包装载体或质粒组合转染或转化进入宿主细胞后，能够持续性高表达，并且不会影响宿主的增殖与非特异性吞噬杀伤。

40、本发明提供了所述靶向her2基因的car元件、核酸、包装载体、质粒组合或表达宿主在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

41、本发明中，所述肿瘤可为her2阳性肿瘤或非her2阳性肿瘤，或者，所述肿瘤为实体瘤或非实体瘤。所述实体瘤包括：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌；所述非实体瘤选自胶质瘤、白血病和/或淋巴瘤。

42、具体的，在本发明的实施例中，将表达质粒组合的单核细胞与her2阳性的skov3卵巢癌细胞共培养，探究其对her2阳性肿瘤的作用。结果表明car单核细胞可以靶向吞噬与杀伤肿瘤细胞，cd147元件促进了mmps分泌，进而增加了car单核细胞的侵袭和迁移能力。

43、本发明还提供了靶向her2基因的car-免疫细胞，其包括本发明所述的car元件、核酸、包装载体、质粒组合或表达宿主。

44、本发明还提供了靶向her2基因的药物，其包括本发明所述的car-免疫细胞，还包括药学上可接受的辅料。

45、本发明所述的药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、ph调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、金属离子螯合剂、抑菌剂或等渗调节剂。

46、本发明提供的靶向her2基因的药物，其剂型包括但不限于溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬性、气体分散型、微粒分散性或固体分散型。

47、具体的，在本发明的实施例中，所述靶向her2基因的药物剂型为溶液型或混悬型，其辅料包括但不限于注射用水、盐酸、亚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、苯酚或氯化钠。

48、本发明还提供了治疗her2阳性肿瘤的方法，其包括给予本发明所述的药物；给药方式为注射给药。

49、本发明提供的包含有重组car元件的car-单核/巨噬细胞来源于永生化人单核细胞系thp-1，克服了car-单核/巨噬细胞来源不足的缺陷，在治疗her2阳性肿瘤时，能够增加mmps的分泌，进而降解肿瘤周围坚硬的基质，促进其他免疫细胞的浸润，解决了car-t在实体瘤中应用局限，浸润不足的问题；在治疗完毕后或治疗中途发现毒副作用时，增加的icaspse9自杀基因能够快速启动多余car-单核/巨噬细胞自杀，减少了毒副作用的产生。