与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用

本发明涉及分子生物学检测技术及南瓜遗传育种，特别是涉及与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用。

背景技术：

1、南瓜是葫芦科(cucurbitaceae)南瓜属(cucurbita)的一年生草本作物，是一种重要菜粮兼用作物，在我国南北方具有较大的种植面积，其果实富含类胡萝卜素、多糖、碳水化合物和人体所需的17种氨基酸，具有抗细菌、降胆固醇、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗突变、驱虫和抗癌等功能，具有极高的食用、药用和保健价值。可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖(多糖、单双糖、果胶)、酸、维生素、矿物质等。可溶性固形物含量是影响果肉口感和风味的重要因素，是果实内部品质检测和评价的重要指标，也一直是南瓜品种改良过程中非常重要的目标性状。

2、单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism，snp)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，包括碱基的颠换、转换、插入和缺失。snp在植物基因组中出现频率高，作为新一代的分子标记，可高效检测群体内变异情况。qtl mapping是在全基因组范围内推断一组数量性状的不同基因组位置的基因型与表型之间的关系，即qtl的数量、基因组位置、效应和相互作用。qtl图谱的主要目的是对显著影响群体中数量性状变异的染色体区域进行定位。竞争性等位基因特异性pcr(kompetitiveallele specific pcr，kasp)是一种基于荧光的同质基因分型技术，在dna样品中对特定位点上的snps和indels进行精准的双等位基因检测。通过上述标记的筛选，可提高南瓜可溶性固形物含量筛选的效率，节约育种成本，最终提高南瓜的经济价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的分子标记与南瓜果肉可溶性固形物含量呈现紧密连锁标记特征，通过kasp技术获得snp分型，可以准确、高效、低成本的鉴定南瓜果实可溶性固形物含量性状，为南瓜品种的选育提供有力的技术支持，从而推动南瓜品质育种改良的进程。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的分子标记，所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；所述分子标记345661的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述分子标记345718的核苷酸序列如seq id no.2所示；

4、所述分子标记345661和分子标记345718定位于南瓜15号染色体上，且均位于4849183-4939469bp区段内。

5、进一步地，所述分子标记345661在第151位碱基处存在a/g突变；所述分子标记345718在第151位碱基处存在c/g突变。

6、本发明还提供一种检测所述分子标记的kasp引物组，检测所述分子标记345661的kasp引物组包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物f1、核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物f2和核苷酸序列如seq id no.5所示的下游引物r；

7、检测所述分子标记345718的kasp引物组包括核苷酸序列如seq id no.6所示的上游引物f1、核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物f2和核苷酸序列如seq id no.8所示的下游引物r。

8、本发明还提供一种所述分子标记的检测试剂或检测试剂盒，包所述的kasp引物组。

9、本发明还提供一种所述的分子标记、所述的kasp引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：

10、(1)鉴定南瓜可溶性固形物含量；

11、(2)筛选高低可溶性固形物含量的南瓜品种或品系；

12、(3)南瓜分子标记辅助育种；

13、(4)改良南瓜种质资源。

14、本发明还提供一种鉴定南瓜可溶性固形物含量高低的方法，包括如下步骤：

15、以待测南瓜样品的基因组dna作为模板，利用所述的kasp引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量pcr扩增，利用扩增结果判断南瓜可溶性固形物含量高低。

16、进一步地，在利用分子标记345661基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345661所在的等位基因中均为a时，检测样品会与特定的fam检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着pcr反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量低的基因型(kasp标记的分型结果定义为：fam)；当所在位点的等位基因碱基均为g时，检测样品会与特定的hex检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着pcr循环数的增加，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实高可溶性固形物含量的基因型(kasp标记的分型结果定义为：hex)；

17、在利用分子标记345718基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345718所在的等位基因中均为c时，检测样品会与特定的fam检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着pcr循环数的增加，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量低的基因型(kasp标记的分型结果定义为：fam)；当分子标记345718所在的等位基因中均为g时，检测样品会与特定的hex检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着pcr反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量高的基因型(kasp标记的分型结果定义为：hex)。

18、进一步地，所述荧光定量pcr扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。

19、进一步地，所述荧光定量pcr扩增的体系为：2×parms master mix 5μl，上游引物f1 0.15μl，上游引物f2 0.15μl，下游引物r 0.4μl和dna模板10-100ng，总体积为10μl。

20、本发明公开了以下技术效果：

21、本发明首次对南瓜的ril群体的南瓜可溶性固形物含量进行了数量性状定位，筛选得到了两个与南瓜可溶性固形物含量连锁的分子标记345661和分子标记345718，针对分子标记345661和分子标记345718进行kasp标记开发，通过kasp技术获得snp分型，能快速批量的对南瓜可溶性固形物含量性状进行鉴定，为南瓜品种的选育提供有力的技术支持，有助于南瓜的分子育种改良，与传统育种筛选相比，本方法可快速筛选与鉴定高可溶性固形物含量的材料，既避免了环境因素对可溶性固形物含量性状的影响，又极大的缩短了育种周期，是一种高效、先进的育种手段。

技术特征：

1.一种与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；所述分子标记345661的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述分子标记345718的核苷酸序列如seq id no.2所示；

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记345661在第151位碱基处存在a/g突变；所述分子标记345718在第151位碱基处存在c/g突变。

3.一种检测权利要求1或2所述分子标记的kasp引物组，其特征在于，检测所述分子标记345661的kasp引物组包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物f1、核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物f2和核苷酸序列如seq id no.5所示的下游引物r；

4.一种权利要求1或2所述分子标记的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的kasp引物组。

5.一种权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3所述的kasp引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：

6.一种鉴定南瓜可溶性固形物含量高低的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若扩增结果显示释放出绿色荧光，则判断待测南瓜样品可溶性固形物含量高；若扩增结果显示释放出蓝色荧光，则判断待测南瓜样品可溶性固形物含量低。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的体系为：2×parmsmastermix5μl，上游引物f10.15μl，上游引物f20.15μl，下游引物r0.4μl和dna模板10-100ng，总体积为10μl。

技术总结
本发明公开了与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，属于分子生物学检测技术及南瓜遗传育种技术领域。所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；分子标记345661的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记345718的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记345661和分子标记345718定位于南瓜15号染色体，且位于4849183‑4939469bp区段内。本发明的分子标记与南瓜果肉可溶性固形物含量呈现紧密连锁标记特征，通过KASP技术获得SNP分型，可以灵敏、高效、低成本的预测果实可溶性固形物含量，推动南瓜分子育种进程。

技术研发人员：徐颖超,钟玉娟,薛舒丹,朱吉童,张思程,孟琦涛
受保护的技术使用者：广东省农业科学院蔬菜研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14