一种高效的Csy4核酸酶切割介导的多基因引导编辑系统CMPE及相关蛋白

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高效的csy4核酸酶切割介导的多基因引导编辑系统cmpe及相关蛋白。

背景技术：

1、基因组单碱基突变以及小片段核苷酸变异是造成基因功能改变的重要原因之一，与许多疾病和农艺性状息息相关。目前，基因组编辑技术(例如crispr/cas9技术)可以实现对特定序列进行编辑并激活细胞的修复途径对损伤处进行合成修复。引导编辑系统(primeeditor,pe)是crispr/cas9系统最新的基因组编辑衍生技术，在不依赖dna双链断裂和供体dna的条件下实现所有12种碱基的替换以及多个碱基的精准插入或删除。pe系统主要由两大部分组成，一是含有引物结合位点(prime binding site,pbs)和包含所需编辑序列的逆转录酶模板(reverse transcriptase template,rt template)的引导rna(prime editingguide rna,pegrna)，二是融合逆转录酶(reverse transcriptase,rt)的ncas9(h840a)蛋白。该系统的工作原理是pbs与ncas9(h840a)切割产生的缺口链，逆转录酶(rt)则以rttemplate序列为模板进行逆转录来延长被切割的dna链，从而将所需要的编辑信息合并到dna链中，经过细胞修复，最终实现基因组的任意改变。

2、crispr/cas9系统可以实现同时编辑多个基因组靶位点，目前，可以通过串联多个grna表达框，或利用核酶(ribozyme,rz)、csy4核糖核酸裂解酶、trna等加工方式实现多个grna在同一个细胞中同时表达。目前研究表明，多基因编辑主要用于实现多个位点同时敲除，而利用同源重组实现的精准编辑效率较低，而引导编辑系统可以实现更加精准的基因组编辑，因此建立基于引导编辑系统的多基因编辑技术体系对疾病治疗和农作物的遗传改良。

3、目前研究表明，pe整体的编辑效率较低，需要做多方面的优化。

4、ppe(plant prime editor)系统通过优化密码子、启动子和编辑条件(工作温度、pbs和rt模板长度等)，在水稻和小麦中成功建立并优化适用于植物的引导编辑系统(相关文献：lin,q.,zong,y.,xue,c.et al.prime genome editing in rice and wheat.natbiotechnol 38,582–585(2020).https://doi.org/10.1038/s41587-020-0455-x)；eppe(engineered prime editor)系统是在ppe系统的基础上，使用删除rnase h结构域的逆转录酶并融合病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid,nc)，将编辑效率平均提高5.8倍(相关文献：zong,y.,liu,y.,xue,c.et al.an engineered prime editor with enhanced editingefficiency in plants.nat biotechnol 40,1394–1402(2022).https://doi.org/10.1038/s41587-022-01254-w)。但其在小麦中的编辑效率仍然较低，因此需要做进一步的优化。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何高效地对生物体进行多基因引导编辑和/或如何提高多基因引导编辑系统的基因编辑效率和/或如何优化多基因引导编辑系统和/或如何提高基因引导编辑系统的基因编辑效率和/或如何获得高效地对生物体进行基因引导编辑。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，所述蛋白质可为下述任一种：

3、1)名称为eppeplus的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列6的蛋白质；

4、2)名称为eppemax*的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列8的蛋白质；

5、3)名称为eppe-v223a的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列10的蛋白质；

6、4)名称为cas9-221-394-rt-v223a的融合蛋白，所述融合蛋白为由cas9-221-394和rt-v223a连接而成的蛋白质，所述cas9-221-394为氨基酸序列是序列6的第30-1396位的蛋白质，所述rt-v223a为序列10的第1492-2005位的蛋白质；

7、5)逆转录酶，所述逆转录酶为所述rt-v223a；

8、6)cas9-221-394，所述cas9-221-394为氨基酸序列是序列6的第30-1396位的蛋白质；

9、7)名称为eppe*的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列12的蛋白质；

10、8)名称为eppeplus-csy4的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列17的蛋白质；

11、9)名称为ppe-cys4的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列19的蛋白质；

12、10)名称为eppe-cys4的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列21的蛋白质；

13、11)名称为eppemax的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列14的蛋白质。

14、上述蛋白质中，所述cas9-221-394-rt-v223a可为氨基酸序列是序列6的第30-2027位的蛋白质。

15、为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上文所述蛋白质相关的生物材料：

16、所述生物材料可为下述b1)至b7)中的任一种：

17、b1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；

18、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

19、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

20、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

21、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

22、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

23、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。上述生物材料中，b1)所述核酸分子可为如下所示的所述蛋白质的编码基因：

24、b1)编码序列是序列表中序列5分子或dna分子；

25、b2)核苷酸是序列表中序列7的cdna分子或dna分子；

26、b3)核苷酸是序列表中序列9的cdna分子或dna分子；

27、b4)核苷酸是序列表中序列5的第88-6081位的cdna分子或dna分子；

28、b5)核苷酸是序列表中序列9的第4474-6015位的cdna分子或dna分子；

29、b6)核苷酸是序列表中序列5的第88-4188的cdna分子或dna分子；

30、b7)编码序列是序列表中序列11的cdna分子或dna分子；

31、b8)编码序列是序列表中序列16的cdna分子或dna分子；

32、b9)编码序列是序列表中序列18的cdna分子或dna分子；

33、b10)编码序列是序列表中序列20的cdna分子或dna分子；

34、b11)编码序列是序列表中序列13的cdna分子或dna分子；

35、b12)与b1)、b2)、b3)、b4)、b5)、b6)、b7)、b8)、b9)、b10)或b11)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。

36、为了解决上述技术问题，本发明还提供了csy4核酸酶切割介导的多个基因引导编辑系统，所述多个基因引导编辑系统可包括引导rna基因表达载体和重组逆转录酶-ncas9融合蛋白基因表达载体，所述引导rna基因表达载体含有多个引导rna基因，所述多个引导rna基因中每个引导rna基因的两侧均连接有csy4核酸酶的识别序列，所述重组逆转录酶-ncas9融合蛋白基因表达载体可含有上文所述融合蛋白的编码基因。所述多个可为大于等于2个。所述多个具体可为2-10个。

37、上文所述多个基因引导编辑系统中，所述多个基因引导编辑系统可含有csy4核酸酶基因表达载体。

38、为了解决上述技术问题，本发明还提供了基因引导编辑系统，所述基因引导编辑系统可包括引导rna基因表达载体和重组逆转录酶-ncas9融合蛋白基因表达载体，所述重组逆转录酶-ncas9融合蛋白基因表达载体可含有上文所述融合蛋白的编码基因。

39、上文所述蛋白和/或上文所述的生物材料的下述任一应用也属于本发明的保护范围：

40、c1)在制备疾病治疗产品中的应用；

41、c2)在植物遗传改良中的应用。

42、上文所述多个基因引导编辑系统和/或上文所述基因引导编辑系统的下述任一应用也属于本发明的保护范围：

43、d1)在制备疾病治疗产品中的应用；

44、d2)在植物遗传改良中的应用。

45、本发明通过改造逆转录酶-ncas9融合蛋白以及改变核定位信号从而增加核酸酶活性或表达量是一种提高pe编辑效率的有效途径。本发明利用优化改造的引导编辑系统(eppe-v223a、eppemax*、eppeplus)并利用csy4核酸酶加工方式在小麦中实现多基因的精准编辑。

46、本发明整体涉及三种提高引导编辑效率的方法以及建立基于引导编辑系统的多基因编辑体系。具体而言，本发明涉及一种在逆转录酶第223位氨基酸引入突变，从而提升向导rna指导的逆转酶-ncas9融合蛋白对目标序列定向修改效率的方法；通过在ncas9蛋白第221位和第394位氨基酸引入突变并改变融合蛋白n端和c端核定位信号序列，从而提高融合蛋白进入细胞核的效率和对目标序列定向修改效率的方法；以及通过结合逆转录酶氨基酸突变与ncas9蛋白氨基酸突变和核定位信号，从而进一步提升向导rna指导的逆转酶-ncas9融合蛋白对目标序列定向修改效率的方法；通过利用上述优化的引导编辑系统建立基于csy4核酸酶切割的多基因引导编辑系统，从而实现多个pegrna同时编辑目标基因组；以及通过所述方法产生的经遗传修饰的生物个体及其后代。

47、本发明包括三种优化引导编辑系统的方法，一是通过在逆转酶蛋白重要结构域引入氨基酸突变，从而提高引导编辑系统的编辑效率。本发明以小麦原生质体为实施例，实验结果表明，将逆转录酶第223位缬氨酸突变为丙氨酸时，可有效提高引导编辑效率。二是通过将ncas9蛋白第221精氨酸突变为赖氨酸，第394位天冬酰胺突变为赖氨酸，并改变逆转录酶-ncas9融合蛋白n端和c端的核定位信号序列，从而提高引导编辑效率。本发明以小麦原生质体为实施例，实验结果表明，该优化方案可有效提高引导编辑效率。另外，通过将两种优化方案叠加即在逆转录酶引入氨基酸突变的同时在ncas9蛋白引入双氨基酸突变并改变核定位信号，在小麦原生质体实验表明，叠加上述两种策略可进一步提高引导编辑系统效率。本发明通过改造上述优化的引导编辑系统(eppeplus)并利用csy4核酸酶加工方式建立多基因引导编辑系统，本发明以小麦原生质体为实施例，实验结果表明，使用csy4多基因编辑策略可以成功在10个靶点实现同时编辑；本发明利用农杆菌介导的转化技术获得多个基因同时编辑的小麦突变体材料。