一种乳酸杆菌的活菌计数方法与流程

本发明属于微生物计数，具体涉及一种乳酸杆菌的活菌计数方法。

背景技术：

1、乳酸杆菌是可使葡萄糖等糖类分解为乳酸的各种细菌的总称，乳酸杆菌广泛分布于自然界，有些菌株是人和动物口腔、肠道及阴道的正常菌群之一，很少致病，除极偶尔引起亚急性细菌性心内膜炎外，对人基本无害。寄生于口腔的乳酸杆菌在龋齿发生中起重要作用。

2、评价微乳酸杆菌培养品质的指标之一就是乳酸杆菌中的活菌数，平板菌落计数法是常用的微生物计数方法，由于乳酸杆菌的芽孢抗逆能力较强，且菌落易在其它培养基中生长，从而影响乳酸杆菌中活菌的计数，经检索现有公开号为cn109609586a的中国专利一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法，所述方法通过将发酵饲料稀释后的样品分别在含有那他霉素的mrs固体培养基、含有链霉素和青霉素的ypd培养基、以及lb培养基上进行计数；但是现有计数方法通过镜检辅助计算酵母菌的活菌存在着计数不准确的缺点，影响对乳酸杆菌培养方法和环境的评判，基于此，我们提出一种乳酸杆菌的活菌计数方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种乳酸杆菌的活菌计数方法，解决了现有计数方法通过镜检辅助计算酵母菌的活菌存在着计数不准确的缺点，影响对乳酸杆菌培养方法和环境评判的问题。

2、现有计数方法通过镜检辅助计算酵母菌的活菌存在着计数不准确的缺点，影响对乳酸杆菌培养方法和环境的评判，基于此，我们提出一种乳酸杆菌的活菌计数方法，所述乳酸杆菌的活菌计数方法包括：获取待检乳酸杆菌培养液；将不同梯度稀释后的乳酸杆菌培养液放入多组无菌培养基中进行无菌培养；将乳酸杆菌稀释液置于计数载玻片内，对乳酸杆菌稀释液进行净化处理，放入电学扫描仪内扫描，获取计数载玻片对应的电学图片；获取多组电学图片，基于菌落计数模型对电学图片进行处理，得到待检乳酸杆菌培养液中活菌数量，并汇总计数，得到计数结果。本申请通过获取多组电学图片，基于菌落计数模型对电学图片进行处理，得到待检乳酸杆菌培养液中活菌数量，同时菌落计数模型能够对电学图片进行分解和校正计数，提高了计数的精准度。

3、本发明是这样实现的，一种乳酸杆菌的活菌计数方法，所述乳酸杆菌的活菌计数方法包括：

4、获取待检乳酸杆菌培养液，其中，待检乳酸杆菌培养液获取时，对待检乳酸杆菌培养液进行梯度稀释；

5、将不同梯度稀释后的乳酸杆菌培养液放入多组无菌培养基中进行无菌培养，其中，所述无菌培养基为bc培养基；

6、取无菌培养基中乳酸杆菌稀释液，将乳酸杆菌稀释液置于计数载玻片内，对乳酸杆菌稀释液进行净化处理，放入电学扫描仪内扫描，获取计数载玻片对应的电学图片；

7、获取多组电学图片，基于菌落计数模型对电学图片进行处理，得到待检乳酸杆菌培养液中活菌数量，并汇总计数，得到计数结果。

8、优选地，所述对待检乳酸杆菌培养液进行梯度稀释的方法，具体包括：

9、获取无菌稀释液，通过无菌稀释液对待检乳酸杆菌培养液进行稀释，得到多组稀释后混合培养液；

10、分别提取多组混合培养液，对混合培养液进行热激活处理；

11、取热处理后的混合培养液，将混合培养液置于20-65℃、ph值为8.8-9.5的无菌袋中培养10-24h；

12、然后向无菌袋中通入惰性气体，其中，惰性气体通入时间为30mi n，然后向无菌袋中加入生物酶混合。

13、优选地，通过无菌稀释液对待检乳酸杆菌培养液进行稀释至10-200倍。

14、优选地，所述对混合培养液进行热激活处理的温度为40-90℃。

15、优选地，所述对待检乳酸杆菌培养液进行梯度稀释的方法，具体还包括：

16、对无菌袋中的混合培养液进行超声处理，然后通过拍打器对无菌袋进行拍打，得到混合均匀的混合培养液。

17、优选地，所述将不同梯度稀释后的乳酸杆菌培养液放入多组无菌培养基中进行无菌培养的方法，具体包括：

18、取无菌培养基和定量的不同梯度稀释后的乳酸杆菌培养液，将乳酸杆菌培养液注入无菌培养基中；

19、向无菌培养基中依次加入生理盐水、链霉素和青霉素，在30-40℃环境下混合培养。

20、优选地，所述链霉素的浓度为300-400ppm，青霉素的浓度为120-150ppm。

21、优选地，所述对乳酸杆菌稀释液进行净化处理的方法，具体包括：

22、对计数载玻片上的乳酸杆菌稀释液用染色剂进行染色，染色次数为2-5次；

23、采用革兰氏碘液染色对染色后的乳酸杆菌稀释液再次进行染色，然后通过乙醇对乳酸杆菌稀释液进行脱色；

24、获取脱色后的乳酸杆菌稀释液，鼓入干燥的惰性气体对乳酸杆菌稀释液进行干燥处理。

25、优选地，所述基于菌落计数模型对电学图片进行处理的方法，具体包括：

26、获取待处理的电学图片；

27、菌落计数模型对电学图片进行信息分解，得到不同尺寸的图像数据信息；

28、以图像数据信息为输入，执行菌落计数模型，实现对电学图片中活菌的三维辨识，得到初始活菌数目和位置信息。

29、优选地，所述基于菌落计数模型对电学图片进行处理的方法，具体还包括：

30、获取初始活菌数目和位置信息，根据所述初始活菌和位置信息的能量响应影响值以及最优能量响应确定所述初始活菌的完整能量响应，判断完整能量响应是否超过预设阈值，若超过，则判断初始活菌为校正后活菌。

31、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

32、本申请通过获取多组电学图片，基于菌落计数模型对电学图片进行处理，得到待检乳酸杆菌培养液中活菌数量，同时菌落计数模型能够对电学图片进行分解和校正计数，提高了计数的精准度。

技术特征：

1.一种乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于，所述乳酸杆菌的活菌计数方法包括：

2.如权利要求1所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述对待检乳酸杆菌培养液进行梯度稀释的方法，具体包括：

3.如权利要求2所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：通过无菌稀释液对待检乳酸杆菌培养液进行稀释至10-200倍。

4.如权利要求3所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述对混合培养液进行热激活处理的温度为40-90℃。

5.如权利要求4所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述对待检乳酸杆菌培养液进行梯度稀释的方法，具体还包括：

6.如权利要求2-

7.如权利要求6所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述链霉素的浓度为300-400ppm，青霉素的浓度为120-150ppm。

8.如权利要求7所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述对乳酸杆菌稀释液进行净化处理的方法，具体包括：

9.如权利要求8所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述基于菌落计数模型对电学图片进行处理的方法，具体包括：

10.如权利要求9所述的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述基于菌落计数模型对电学图片进行处理的方法，具体还包括：

技术总结
本发明公开了一种乳酸杆菌的活菌计数方法，属于微生物计数技术领域，解决了现有计数方法通过镜检辅助计算酵母菌的活菌存在着计数不准确的缺点，影响对乳酸杆菌培养方法和环境评判的问题，方法包括：获取待检乳酸杆菌培养液；将不同梯度稀释后的乳酸杆菌培养液放入多组无菌培养基中进行无菌培养，对乳酸杆菌稀释液进行净化处理，放入电学扫描仪内扫描，获取计数载玻片对应的电学图片；基于菌落计数模型对电学图片进行处理，并汇总计数，得到计数结果；本申请通过获取多组电学图片，基于菌落计数模型对电学图片进行处理，得到待检乳酸杆菌培养液中活菌数量，同时菌落计数模型能够对电学图片进行分解和校正计数，提高了计数的精准度。

技术研发人员：周元元,邹勇平,李奇,王帅,胡云,杨嘉,卢伟,何旭东
受保护的技术使用者：扬州市食品药品检验检测中心（扬州市药品不良反应监测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11