茶碱检测试剂盒的制作方法

本技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称g6pdh)及其在茶碱检测试剂盒中的应用。

背景技术：

1、半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

2、半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。

3、小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等elisa测定多用此法。

4、茶碱(theophyline，theo)属于黄嘌呤类生物碱。茶碱通常制成水溶性较高的盐类(如氨茶碱)供药用，但在体内仍解离出茶碱而发挥作用。

5、茶碱是一种支气管平滑肌松弛药，是治疗支气管哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病等呼吸性疾病的有效药物。在《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》和《支气管哮喘防治指南》中均有收录。近几年的研究表明，茶碱还具有强心、利尿、抗炎、免疫调节、扩张冠状动脉和兴奋中枢神经系统等作用。

6、由于茶碱类药物的广泛应用，在患者中的不良反应案例也相应增多，比较多见的不良反应包括恶心、呕吐、胃寒，心动过速，也有些患者会有神经系统症状产生。根据研究显示，患者使用茶碱类药物后的不良反应发生情况和患者的血药浓度有直接关系。对于大多数患者来说，茶碱的血药浓度在10至20μg/ml之间可以有效缓解慢性哮喘和其他支气管痉挛症状。茶碱的血药浓度在5至10μg/ml之间可以控制新生儿呼吸暂停发作，并且没有明显的副作用。

7、然而，血药浓度超过20μg/ml时会出现以下不良反应：恶心、头痛、腹泻。血药浓度更高时，会出现呕吐、胃肠道出血、癫痫发作和心率失常。

8、由于茶碱的治疗指数窄，而代谢率和清除率的个体间差异大，继而导致不良反应或治疗效果差等情况的发生。因此，监测患者的血药浓度，随时进行药量调整，对于降低患者不良反应发生率以及提高治疗效果就显得尤为重要了。

9、目前已知的茶碱检测方法主要有：有高效液相色谱法、乳胶增强免疫比浊法、化学发光微粒子免疫、酶联免疫吸附法等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(emit)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

10、均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如g6pdh-茶碱)与非标记抗原(茶碱)，竞争与定量的抗体(茶碱抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物nad+生成nadh就越多，在340nm波长下检测nadh的吸光度变化，即可推算出液体中茶碱的含量。

技术实现思路

1、鉴于本领域的需求，本技术提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备茶碱检测试剂盒中的用途。

2、根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利us006090567a(homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：d306c、g426c、d375c。

3、根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4。

4、根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。

5、根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本技术的多核苷酸。

6、根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本技术的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。

7、根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成。

8、在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100da至4000da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。

9、根据本技术，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如茶碱)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本技术中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。

10、半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。

11、半抗原例如但不限于：茶碱、苯妥英、维生素d、25羟维生素d、1，25双羟维生素d、叶酸、强心甙、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素a、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、降钙素、降钙素原、甲状旁腺激素、甲状腺素、三碘甲状原氨酸、反三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、皮质醇、尿17-羟皮质类固醇、尿17-酮类固醇、脱氢表雄酮及硫酸酯、醛固酮、尿香草苦杏仁酸、血浆肾素、血管紧张素、促红细胞生成素、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、17α羟孕酮、雌酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素原、c肽、胃泌素、血浆前列腺素、血浆6-酮前列腺素f1α、前列环素、肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、胆囊收缩素、纳素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、血管活性肽、生长抑素、促胰液素、p-物质、神经降压素、血栓素a2、血栓素b2、5羟色胺、神经肽y、骨钙素。

12、在具体的实施方案中，半抗原是茶碱或其衍生物。

13、在具体的实施方案中，半抗原是茶碱衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。在具体的实施方案中，半抗原是茶碱衍生物，如式i所示：

14、

15、根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本技术的偶联物。

16、根据一些实施方案，提供了本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备茶碱检测试剂中的用途。

17、根据一些实施方案，提供了本技术的偶联物在制备茶碱检测试剂中的用途。

18、在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。

19、在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。

20、根据一些实施方案，提供了一种茶碱检测试剂盒，其包含：

21、-第一试剂，所述第一试剂包含底物和茶碱抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；

22、-第二试剂，所述第二试剂包含本技术的偶联物；

23、-任选地，校准品，所述校准品包含10mm至500mm缓冲液、0mg/l至40mg/l茶碱；以及

24、-任选地，质控品，所述质控品包含10mm至500mm缓冲液、0mg/l至40mg/l茶碱。

25、根据一个的实施方案，提供了一种茶碱检测试剂盒，其包含：

26、第一试剂，其包含：

27、10mm至500mm缓冲液、

28、0.5g/l至20g/l底物、

29、0.1mg/l至10mg/l的茶碱抗体、

30、10mm至300mm nacl、

31、0.1g/l至5g/l稳定剂、

32、0.1g/l至5g/l表面活性剂、

33、0.1g/l至5g/l防腐剂；

34、第二试剂，其包含：

35、10mm至500mm缓冲液、

36、根据本技术的偶联物、

37、0.1g/l至5g/l稳定剂、

38、0.1g/l至5g/l表面活性剂、

39、0.1g/l至5g/l防腐剂。

40、在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/l至500mmol/l，优选100mm；所述缓冲液的ph为7至8，优选7.2或者7.0。在一些具体的实施方案中，缓冲液的浓度是100mm。

41、在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。在一些具体的实施方案中，稳定剂的浓度为1.0g/l。

42、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：brij35、tritiom x-100、tritiom x-405、tween20、tween30、tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、aeo7，优选tween20。在一些具体的实施方案中，表面活性剂的浓度为1.0g/l。

43、在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、mit、pc-300、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。在一些具体的实施方案中，防腐剂的浓度为1.0g/l。

44、在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。在一些具体的实施方案中，g6pdh酶催化反应的底物浓度为15g/l。

45、在一些具体的实施方案中，茶碱抗体的浓度为5.7mg/l。

46、根据一些实施方案，提供了一种偶联物的制备方法，其包括步骤：

47、提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

48、提供茶碱或其衍生物；

49、所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与所述茶碱或其衍生物按照摩尔比1：1偶联。

50、在一些具体的实施方案中，偶联物的制备方法包括步骤：

51、1)在非质子性溶剂中提供茶碱衍生物；

52、2)在缓冲液中提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

53、3)在18℃至28℃，将所述茶碱衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体接触1小时至4小时，优选2小时至3小时，使得所述茶碱衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述偶联物；

54、4)任选，对所述偶联物进行纯化，优选脱盐。

55、其中，步骤1)和2)可互换。

56、在一些具体的实施方案中，非质子性溶剂选自以下一种或组合：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。

57、在一些具体的实施方案中，在步骤3)之前，6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含一个或多个(优选一个)游离巯基，尤其是在第306、375或426位存在游离的巯基。