一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取dna是pcr扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本。目前已知的酚氯仿法、吸附柱法、磁珠法等现有dna提取方法中可用于血液dna提取。其中，酚氯仿法由于在提取过程中使用了有毒有害的有机溶剂，具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长的缺陷。目前主要的核酸提取方法包括硅胶膜吸附柱法和磁珠法。柱法提取能获得高纯度核酸，但是提取步骤繁琐，需多次离心，整个流程耗时长。磁珠法提取结合自动化提取仪器，相较于柱法提取，能大幅缩短提取时间，但是多样本同时操作存在交叉污染的风险，提取仪器及试剂的成本也比较高。

2、现在医学实验室中广泛采用分子诊断学的主要瓶颈是要求从样品中纯化核酸，尤其是疾病(癌症)治疗手术中的检测，因此，急需研发安全、简便、快速、质量高的核酸提取方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法。

2、第一方面，本发明要求保护一种用于核酸提取纯化的试剂。

3、本发明所要求保护的用于核酸提取纯化的试剂，包括细胞裂解液、消化酶、结合液、漂洗液和洗脱液；其中，所述结合液中含有醇溶液和钾盐。

4、进一步地，所述醇溶液为无水乙醇或异丙醇。

5、进一步地，所述钾盐为乙酸钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。

6、在本发明的具体实施方式中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1-0.5％；所述结合液的ph为6.0-8.0。

7、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1％；所述结合液的ph为6.0。在本发明的第二个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.3％；所述结合液的ph为7.0。在本发明的第三个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.5％；所述结合液的ph为8.0。

8、进一步地，所述裂解液中可含有tris-hcl、胍盐、edta、非离子表面活性剂和nacl，ph值为5.0-8.0。

9、进一步地，所述漂洗液由漂洗液a1和漂洗液a2组成；所述漂洗液a1中可含有盐酸胍和无水乙醇，ph值为6.0-8.0；所述漂洗液a2中可含有kac、tris-hcl和无水乙醇，ph值为7.0-9.0。

10、进一步地，所述洗脱液中可含有tris-hcl，ph值为7.0-9.0。

11、在本发明的具体实施方式中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5-3.0mol/l胍盐、0.05-0.3mol/l edta、体积百分比为3-10％(如3.2-10％)的非离子表面活性剂、0.5-3mol/l nacl，0.05-0.3mol/l tris-hcl。各浓度为在所述裂解液中的终浓度。

12、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5mol/l胍盐(盐酸胍)、0.05mol/l edta、体积百分比为3.2％的非离子表面活性剂(0.1％曲拉通100、3％吐温20、0.1％ np40)、0.5mol/l nacl、0.05mol/l tris-hcl；所述裂解液的ph为5.0。在本发明的第二个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.5mol/l胍盐(盐酸胍)、0.15mol/l edta、体积百分比为7％的非离子表面活性剂(0.5％曲拉通100、6％吐温20、0.5％ np40)、1.5mol/l nacl、0.15mol/l tris-hcl；所述裂解液的ph为6.5。在本发明的第三个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：3.0mol/l胍盐(盐酸胍)、0.3mol/l edta、体积百分比为10％的非离子表面活性剂(1％曲拉通100、8％吐温20、1％ np40)、3mol/lnacl、0.3mol/l tris-hcl；所述裂解液的ph为8.0。上述各浓度为在所述裂解液中的终浓度。

13、在本发明的具体实施方式中，所述漂洗液a1的溶剂为水，溶质及浓度如下：

14、1-8mol/l盐酸胍，体积百分比为60％-80％的无水乙醇。各浓度为在所述漂洗液a1中的终浓度。

15、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述漂洗液a1的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/l盐酸胍，体积百分比为60％的无水乙醇；所述漂洗液a1的ph为6.0。在本发明的第二个实施案例中，所述漂洗液a1的溶剂为水，溶质及浓度如下：4mol/l盐酸胍，体积百分比为70％的无水乙醇；所述漂洗液a1的ph为7.0。在本发明的第三个实施案例中，所述漂洗液a1的溶剂为水，溶质及浓度如下：8mol/l盐酸胍，体积百分比为80％的无水乙醇；所述漂洗液a1的ph为8.0。上述各浓度为在所述漂洗液a1中的终浓度。

16、在本发明的具体实施方式中，所述漂洗液a2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01-1.0mol/l kac、体积百分比为70-80％无水乙醇，1-10mol/l tris-hcl。上述各浓度为在所述漂洗液a2中的终浓度。

17、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述漂洗液a2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01mol/l kac、体积百分比为70％无水乙醇、1mol/l tris-hcl；所述漂洗液a2的ph为7.0。在本发明的第二个实施案例中，所述漂洗液a2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.05mol/l kac、体积百分比为75％无水乙醇、5mol/l tris-hcl；所述漂洗液a2的ph为8.0。在本发明的第三个实施案例中，所述漂洗液a2的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/l kac、体积百分比为80％无水乙醇、10mol/l tris-hcl；所述漂洗液a2的ph为9.0。上述各浓度为在所述漂洗液a2中的终浓度。

18、在本发明的具体实施方式中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2-10mol/l tris-hcl。浓度为在所述洗脱液中的终浓度。

19、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2mol/l tris-hcl；所述洗脱液的ph为7.0。在本发明的第二个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：6mol/l tris-hcl；所述洗脱液的ph为8.0。在本发明的第三个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：10mol/ltris-hcl；所述洗脱液的ph为9.0。上述各浓度为在所述洗脱液中的终浓度。

20、进一步地，在所述裂解液中，所述胍盐可为异硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸胍的至少一种。

21、在本发明的具体实施方式中，所述胍盐为盐酸胍。

22、进一步地，在所述裂解液中，所述非离子表面活性剂可为曲拉通100、吐温20、sds和np40中的至少一种；

23、在本发明的具体实施方式中，所述非离子表面活性剂具体由曲拉通100、吐温20、和np40组成。在所述裂解液中，曲拉通100的浓度可为0.1-1％、吐温20的浓度可为3-8％、np40的浓度可为0.1-1％。上述各％均表示体积百分比。

24、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为0.1％、吐温20的浓度为3％、np40的浓度为0.1％。在本发明的第二个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为0.5％、吐温20的浓度为6％、np40的浓度为0.5％。在本发明的第三个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为1％、吐温20 的浓度为8％、np40的浓度为1％。上述各％均表示体积百分比。

25、进一步地，所述消化酶可为蛋白酶k(生产商：天根生化科技(北京)有限公司，货号：rt403-02)。

26、更进一步地，所述蛋白酶k的浓度可为10-20mg/ml。

27、具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述蛋白酶k的浓度为10mg/ml。在本发明的第二个实施案例中，所述蛋白酶k的浓度为15mg/ml。在本发明的第三个实施案例中，所述蛋白酶k的浓度为20mg/ml。

28、第二方面，本发明要求保护一种用于核酸提取纯化的试剂盒。

29、本发明要求保护的用于核酸提取纯化的试剂盒，包括前文第一方面中所述的试剂。

30、进一步地，所述试剂盒中还可包含有吸附物。

31、在本发明中，所述吸附物是指能够将核酸特异性地吸附在其表面，并在特定的条件下能够特异性地与核酸相分离的物质。

32、更进一步地，所述吸附物可为吸附柱。

33、在本发明的具体实施方式中，所述吸附柱具体为吸附柱tc1。

34、第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的试剂或前文第二方面中所述的试剂盒在进行核酸提取纯化中的应用。

35、第四方面，本发明要求保护一种核酸提取纯化方法。

36、本发明要求保护的核酸提取纯化方法，可包括如下操作步骤：

37、s1.将待提取样本加入无rna酶的离心管中，依次加入前文第一方面中所述的裂解液和前文第一方面中所述的消化酶，盖上管盖，瞬时离心；

38、s2.将s1处理后的样品金属浴或水浴孵育10-20分钟(如20分钟)后，加入结合液盖上管盖，瞬时离心；

39、其中，所述金属浴或水浴孵育温度可设置为50℃。

40、s3.将s2处理后样品转移到前文第二方面中所述的吸附物中，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

41、s4.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液a1，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

42、s5.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液a2，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

43、s6.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液a2，13400g离心2-4min(如1.5min)，弃滤液，将所述吸附物放入1-2ml(如2ml)ep管中，开盖室温放置2-5min；

44、s7.向吸附物中央悬空加入前文第一方面中所述的洗脱液，室温静置2-5min，13400g离心1min，弃所述吸附物，得到核酸产物。

45、更加具体地，所述s1具体操作如下：吸取150-300μl(如200μl)所述待提取样本加入rnase-free的离心管中，依次加入150-300μl(如200μl)裂解液和10-50μl(如20μl)消化酶至相应的离心管中，盖上管盖，涡旋10-35秒(如20秒)，瞬时离心；

46、更加具体地，所述s2具体操作如下：金属浴或水浴(温度50℃)孵育10-20分钟(如20分钟)后，加入150-300μl(如200μl)结合液相应的离心管中，盖上管盖，涡旋10-15秒(如15秒)，瞬时离心；

47、更加具体地，所述s3具体操作如下：将上述混合液转移到所述吸附物中，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

48、更加具体地，所述s4具体操作如下：向所述吸附物中加入300-500μl(如300μl)所述漂洗液a1，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

49、更加具体地，所述s5具体操作如下：向所述吸附物中加入400-800μl(如600μl)所述漂洗液a2，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；

50、更加具体地，所述s6具体操作如下：向所述吸附物中加入150-400μl(如200μl)所述漂洗液a2，10000rpm(相当于13400g)离心2-4min(如1.5min)，弃滤液，将所述吸附物放入1-2ml(如2ml)ep管中，开盖室温放置2-5min；

51、更加具体地，所述s7具体操作如下：向所述吸附物的中央悬空加入50-100μl(如70μl)洗脱液，室温静置2-5min，10000rpm(相当于13400g)离心1min，弃所述吸附物，得到核酸产物。

52、其中，所述待提取样本可来自于动物样本。所述待提取样本可为细胞、细菌、血液、唾液、尿液或胸腹水。优选的，所述待检测样本为血液。

53、在本发明的具体实施方式中，所述待提取样本具体为人全血样本。

54、本发明提取纯化试剂可适用于新鲜或冻存的抗凝全血样本。

55、在本发明的一些实施例中所述分离的核酸优选地是脱氧核糖核酸(dna)。

56、本发明的有益效果是：

57、(1)与市场上现有同类试剂盒相比本发明的结合液中除了无水乙醇外还加入了乙酸钾试剂，该试剂的加入可使dna提取物高效率选择性吸附于离心柱硅基质膜，所得核酸的得率和纯度显著提高；

58、(2)本发明采用了独家的硅胶模纯化技术，可有效降低生产成本；

59、(3)本发明采用碱裂解法快速提取dna，提取流程中不涉及酚、氯仿等有毒试剂，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念，能更好地满足临床使用条件，也不需耗费大量时间进行醇类沉淀，安全高效，省时省力；

60、(4)本发明能够将rna、杂蛋白、脂类及其他抑制性杂质最大限制的除去，提取得到的基因组dna纯度高，质量稳定，可以用于甲基化、pcr、酶切、southern杂交等多种场景的下游实验，适用于大批量样本的高效处理，具有广阔的应用前景。