重组人腺病毒5型-诺如病毒GII.4-VP1毒株及其制备方法和应用与流程

本发明属于病毒学，具体涉及一株重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、诺如病毒(noroviruses，novs)为杯状病毒科(caliciviridae family)诺如病毒属(norovirus genus)的单股正链rna病毒，是引起急性肠胃炎的主要病原体之一。根据其病毒衣壳蛋白基因(vp1)编码的氨基酸序列差异，可将诺如病毒分为7个不同的基因组：gⅰ～gⅶ。gⅰ、gⅱ、gⅳ有在人际中传播的能力。其中，gⅱ组4型(gii.4)是目前世界范围内引发急性肠胃炎病例最多的诺如病毒优势流行株。

2、诺如病毒没有合适的体外细胞培养体系，使得诺如病毒疫苗的研发进程受到了严重的限制。诺如病毒衣壳由主要结构蛋白vp1和次要结构蛋白vp2组成。研究表明，仅由90个二聚体形式的vp1，共180个亚基即可以自组装形成一个直径约40nm的二十面体病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)。由vp1蛋白包装形成的vlps在形态和抗原性上与具有传染性的诺如病毒颗粒类似。

3、口服给药对诺如病毒疫苗而言，是一种极具吸引力的给药方式。与传统的肌肉注射相比，口服免疫途径能够将疫苗直接递送到诺如病毒的侵染部位。而因为人腺病毒5型(had5)能够感染人的肠道组织，当将重组腺病毒递送到肠道部位后，重组腺病毒能够进入到黏膜细胞，在细胞内部表达其所携带的抗原基因。产生的抗原蛋白能有效刺激机体黏膜免疫反应，产生特异性iga，从而使机体能够抵抗病毒的感染。因此，研究以腺病毒5型作为载体的诺如病毒疫苗对诺如病毒的防治具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一株重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株(recombinant human adenovirus)。所述毒株命名为rad5/nov-gⅱ.4-vp1，已于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，湖北武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no：v202308。

2、该毒株能够在哺乳动物细胞中高效表达诺如病毒的目的蛋白，并自组装为诺如病毒的病毒样颗粒。

3、本发明的第二个目的是提供所述重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株(recombinant human adenovirus)的制备方法，该方法通过基因重组技术将诺如病毒的目的蛋白的基因插入腺病毒5型的基因组中构建出重组质粒，该重组质粒经酶切线性化、转染、病毒拯救、纯化等步骤获得重组腺病毒颗粒。

4、具体的，该方法包括以下步骤：

5、重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株(recombinant human adenovirus)的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)将诺如病毒的目的蛋白的基因序列插入到包含腺病毒5型的基因组的单拷贝质粒中构建重组质粒；

7、(2)将所述重组质粒经酶切线性化后，转染至哺乳动物细胞中进行传代培养，拯救出重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1，收集含病毒样颗粒的病毒收获液；

8、(3)对所述病毒收获液进行扩大培养、纯化，得到重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株。

9、作为本发明的一种实施方式，所述腺病毒5型为e1基因缺失的复制缺陷型病毒。

10、作为本发明的一种实施方式，所述腺病毒5型的载体为pad5。

11、作为本发明的一种实施方式，所述哺乳动物细胞为293t细胞。

12、作为本发明的一种实施方式，步骤(1)的方法包括以下步骤：通过pcr方法获取所述目的蛋白的基因及两侧的同源序列后，再通过pcr搭桥的方式将所述同源序列与所述目的蛋白的基因连接；将连接后的基因电转入已插入了λ-噬菌体red重组酶基因并含有腺病毒5型载体的e.coli菌株中，热诱导后再经蓝白斑筛选即得到所述重组质粒。

13、作为本发明的一种实施方式，步骤(2)的方法包括以下步骤：将所述重组质粒经pacⅰ酶切后，利用lipofectaminetm 2000转染哺乳动物细胞，拯救得到的病毒收获液记为p0代；将p0代病毒收获液在所述哺乳动物细胞上进行连续传代培养至p3代。

14、作为本发明的一种实施方式，步骤(3)中的纯化包括以下步骤：将传代培养中获得的p3代病毒收获液在所述哺乳动物细胞的十层细胞工厂中培养、表达后，于-50℃/+25℃反复冻融3次，破碎细胞，释放病毒；将冻融后的细胞收获液离心，得到的上清经100kda膜包过滤浓缩、蔗糖垫底后用cscl溶液进行密度梯度离心；抽取目标条带经超速离心去除cscl后得到纯化的病毒样颗粒原液。

15、优选的，所述蔗糖的浓度为25％(质量体积比)。

16、优选的，所述cscl溶液的终密度为1.31g/ml。

17、优选的，所述超速离心的速度为28000rpm。

18、本发明的第三个目的是提供所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株表达的诺如病毒gii.4的病毒样颗粒。

19、本发明的第四个目的是将所述诺如病毒gii.4的病毒样颗粒用于制备预防或/和治疗诺如病毒的产品。优选的，该产品为诺如病毒gii.4型病毒疫苗。

20、本发明的第五个目的是将所述重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株用于制备预防或/和治疗诺如病毒的产品。优选的，该产品为诺如病毒gii.4型病毒疫苗。

21、本发明具有以下有益效果：本发明构建的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株在目的基因前端添加了kozak序列(gccaccaugg)，能够在哺乳动物细胞中高效表达诺如病毒的目的蛋白，并自组装为构象结构、免疫原性与天然诺如病毒颗粒类似的诺如病毒病毒样颗粒。同时，由于该毒株在自然情况下能够侵染人的肠道组织，以该毒株为基础构建的诺如腺病毒载体疫苗，纯化后经灌胃给药方式免疫balb/c小鼠模拟口服给药，侵染肠道黏膜组织后表达可自组装成nov-gⅱ.4-vlp的nov-gⅱ.4-vp1蛋白，能够有效诱导小鼠体液及黏膜免疫反应，证明该毒株表达的病毒样颗粒经口服给药同样能刺激小鼠产生高效的中和效果，同时刺激小鼠肠道部位产生黏膜iga。本发明中构建重组腺病毒载体pad5/nov-gⅱ.4-vp1时使用的是包含e1缺失的腺病毒5型基因组的单拷贝质粒，比现有技术中的构建方法的周期更短。由于该病毒样颗粒是利用哺乳细胞表达并自组装而成，与利用昆虫细胞、大肠杆菌、毕赤酵母等表达系统表达的病毒样颗粒相比，哺乳动物细胞辅助脚手架蛋白及翻译后修饰蛋白，更利于表达vp1折叠和修饰，使组装的vlp更接近于天然构象，更容易在肠道部位刺激机体产生针对抗诺如病毒的黏膜免疫应答。本发明为以腺病毒为载体的诺如病毒疫苗的研发奠定了基础。

技术特征：

1.一株重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株，其特征在于，所述毒株命名为rad5/nov-gⅱ.4-vp1，已于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202308。

2.权利要求1所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株的制备方法，其特征在于，所述腺病毒5型为e1基因缺失的复制缺陷型病毒。

4.根据权利要求2所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株的制备方法，其特征在于，步骤(1)的方法包括以下步骤：通过pcr方法获取所述目的蛋白的基因及两侧的同源序列后，再通过pcr搭桥的方式将所述同源序列与所述目的蛋白的基因连接；将连接后的基因电转入已插入了λ-噬菌体red重组酶基因并含有腺病毒5型载体的e.coli菌株中，热诱导后再经蓝白斑筛选即得到所述重组质粒。

5.根据权利要求2所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株的制备方法，其特征在于，步骤(2)的方法包括以下步骤：将所述重组质粒经pac ⅰ酶切后，利用lipofectaminetm2000转染哺乳动物细胞，拯救得到的病毒收获液记为p0代；将p0代病毒收获液在所述哺乳动物细胞上进行连续传代培养至p3代。

6.根据权利要求2所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的纯化包括以下步骤：将传代培养中获得的p3代病毒收获液在所述哺乳动物细胞的十层细胞工厂中培养、表达后，于-50℃/+25℃反复冻融3次，破碎细胞，释放病毒；将冻融后的细胞收获液离心，得到的上清经100kda膜包过滤浓缩、蔗糖垫底后用cscl溶液进行密度梯度离心；抽取目标条带经超速离心去除cscl后得到纯化的病毒样颗粒原液。

7.权利要求1所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株表达的诺如病毒gii.4病毒样颗粒。

8.权利要求1所述的重组人腺病毒5型-诺如病毒gii.4-vp1毒株或权利要求7所述的诺如病毒gii.4病毒样颗粒在制备预防或/和治疗诺如病毒的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预防或/和治疗诺如病毒的产品为诺如病毒gii.4型病毒疫苗。

技术总结
本发明提供一株重组人腺病毒5型‑诺如病毒GII.4‑VP1毒株及其制备方法和应用，属于病毒学技术领域。本发明通过基因重组技术将诺如病毒的目的蛋白的基因插入包含腺病毒5型的基因组的单拷贝质粒中构建出重组质粒，然后经酶切线性化、转染、病毒拯救、纯化等步骤获得重组腺病毒颗粒。其表达的病毒样颗粒的构象与天然诺如病毒类似，且颗粒形态完整。该重组腺病毒颗粒经灌胃给药小鼠后，可诱导诺如病毒中和抗体及肠道黏膜IgA的产生。本发明证实了以重组人腺病毒5型为载体，表达的诺如病毒的目的蛋白可在哺乳动物细胞中自组装形成诺如病毒VLP，为以人腺病毒为载体的诺如病毒口服疫苗的研发提供了技术支持。

技术研发人员：申硕,汪梦俊,裴捷,于代冠,刘睿伦,周金戈,王泽鋆,郭靖,孟胜利
受保护的技术使用者：武汉生物制品研究所有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14