一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测领域，尤其是涉及一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重地危害着女性的健康。人乳头瘤病毒（human papilloma virus, hpv）感染是诱发宫颈癌的根本原因。hpv是一种无包膜的环状、双链、小dna病毒，主要感染人皮肤和粘膜上皮细胞，诱发疣状增生和良恶性肿瘤。依据外壳蛋白l1的基因同源性，hpv可分为不同的亚型，目前已分离鉴定出亚型高达118种。根据感染部位不同，可分为嗜皮肤组和嗜黏膜组两大类。嗜黏膜组可根据感染后诱发病变的情况不同进行细分，根据 hpv 的致病力及引起疾病的危重程度，分为高危型hpv 和低危型hpv：其中hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59等14种属于诱发上皮组织恶性增生的高危型hpv，与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，也与口咽、肛门、阴道、阴唇及阴茎癌的发生有关。有效快捷的hpv检测手段，及时发现宫颈癌患者的癌前病变，对宫颈癌进行有效预防和及时治疗，是提高宫颈癌患者生存率的关键所在。

2、近年来，hpv检测技术日益增多，方法层出不穷。临床上采用的hpv产品多采用以下两种技术：针对靶点的pcr扩增和酶切信号放大技术。基于荧光定量pcr技术，有较高的灵敏度和特异度，可对病毒载量进行测定，也可以进行hpv具体分型。基于通用引物pcr技术，虽然对hpv的检出率较高，但不能进行hpv的分型，对于某些hpv型别甚至无法扩增，不适用于hpv的多重感染。导流杂交法是一种针对hpv l1基因进行的pcr扩增，可确定hpv基因型别，可以判断是否多重感染。流氏荧光杂交技术（液相芯片技术），是一种高通量检测技术，针对hpv的l1和l2进行检测，可以查出13种hpv型别，并进行分型，可以判断是否多重感染，速度较快，但对检测设备要求较高，花费较大。酶切放大信号技术是通过放大与hpv-dna中的l1基因结合的化学信号来检测hpv病毒的dna或rna。可进行定性和半定量，但不能区分具体型别，对hpv的检出有较好的敏感性和特异性，可直接检测hpv-dna序列，具有较好的灵敏度及特异度。

3、阴道镜检查及宫颈活体组织检查等病理检查结果为宫颈癌诊断的“金标准”。组织病理和免疫组化等形态学可以证实hpv-dna的表达，直接定位hpv病毒蛋白表达的位置，确认hpv导致的疾病类型，但其灵敏度较低，特异性较差，操作繁琐，且不利于患者的广泛筛查。

4、目前，临床上宫颈癌的筛查方法，以hpv l1基因为检测靶点，hpv病毒在整合到宿主dna时，l1壳蛋白容易发生丢失，导致表达减少或缺失，在检测中易造成假阴性。

5、e6、e7是主要的致癌基因，在感染至宿主的过程中编码致癌蛋白e6、e7。e6和e7蛋白在导致恶性肿瘤过程中发挥着重要的作用。e6和e7蛋白都可通过与转录因子的结合并使其失活，从而导致细胞肿瘤的发生。hpv e6/e7 mrna的检测，从转录水平及转录后调控着手，提高宫颈癌检出率，简单方便，有较高的敏感性和特异性，可以提示病毒基因的活性状态和癌变的进展程度，是目前筛查宫颈癌变的有效方法。

技术实现思路

1、在深入的研究过程中，本发明人意外地发现某些(hr)-hpv e6/e7基因mrna选择性剪切转录本在宫颈癌癌变组织中特异性存在，通过检测该类转录本，可以评估宫颈癌癌变趋势。

2、有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，并利用意外发现的优势，提出一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒。

3、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

4、第一方面，本发明提供了一种特异性高危型(hr)-hpv e6/e7 mrna的引物探针组，所述引物探针组的反转录扩增片段序列位于(hr)-hpv e6/e7基因mrna选择性剪切转录本上从原e6翻译起始位点上游-40nt至下游+420nt 区间。

5、优选地，所述引物探针组用于检测的以下14种高危型(hr)-hpv亚型：hpv16型、hpv18型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型中的任意一种或多种。

6、优选地，所述扩增片段的核酸序列如序列表seq id no:1~15所示或与序列表seqid no:1~15具有92%以上同一性的核酸序列。

7、优选地，所述引物探针组包括如下15个引物探针组：

8、用于检测hpv16型的引物探针组一由序列表seq id no:16所示的上游引物16dark-f2、序列表seq id no:17所示的下游引物16e7r和序列表seq id no:18所示的探针16p1组成；

9、用于检测hpv16型的引物探针组二由序列表seq id no:19所示的上游引物16f2、序列表seq id no:20所示的下游引物16r2和序列表seq id no:21所示的探针16p-2组成；

10、用于检测hpv18型的引物探针组由序列表seq id no:22所示的上游引物18f、序列表seq id no:23所示的下游引物18qr-darkr3和序列表seq id no:24所示的探针18p1组成；

11、用于检测hpv31型的引物探针组由序列表seq id no:25所示的上游引物31f19724、序列表seq id no:26所示的下游引物31r35423和序列表seq id no:27所示的探针31pp28229组成；

12、用于检测hpv33型的引物探针组由序列表seq id no:28所示的上游引物33f21724、序列表seq id no:29所示的下游引物33r36921和序列表seq id no:30所示的探针33p24530组成；

13、用于检测hpv35型的引物探针组由序列表seq id no:31所示的上游引物35f21824、序列表seq id no:32所示的下游引物35r37022和序列表seq id no:33所示的探针35p24626组成；

14、用于检测hpv39型的引物探针组由序列表seq id no:34所示的上游引物39f23120、序列表seq id no:35所示的下游引物39r37018和序列表seq id no:36所示的探针39p25223组成；

15、用于检测hpv45型的引物探针组由序列表seq id no:37所示的上游引物45f225、序列表seq id no:38所示的下游引物45r313和序列表seq id no:39所示的探针45p254组成；

16、用于检测hpv51型的引物探针组由序列表seq id no:40所示的上游引物51f16829、序列表seq id no:41所示的下游引物5h1qr-2和序列表seq id no:42所示的探针5h1qp20625组成；

17、用于检测hpv52型的引物探针组由序列表seq id no:43所示的上游引物52f20226、序列表seq id no:44所示的下游引物52r35020和序列表seq id no:45所示的探针52p22828组成；

18、用于检测hpv56型的引物探针组由序列表seq id no:46所示的上游引物56f21923、序列表seq id no:47所示的下游引物56r31328和序列表seq id no:48所示的探针56p20组成；

19、用于检测hpv58型的引物探针组由序列表seq id no:49所示的上游引物58f21723、序列表seq id no:50所示的下游引物58r32818和序列表seq id no:51所示的探针58p24626组成；

20、用于检测hpv59型的引物探针组由序列表seq id no:52所示的上游引物5h9fa、序列表seq id no:53所示的下游引物59r35925和序列表seq id no:54所示的探针59p21925组成；

21、用于检测hpv66型的引物探针组由序列表seq id no:55所示的上游引物66f21226、序列表seq id no:56所示的下游引物66r30526和序列表seq id no:57所示的探针66p24824组成；

22、用于检测hpv68型的引物探针组由序列表seq id no:58所示的上游引物68f11222、序列表seq id no:59所示的下游引物68r27819和序列表seq id no:60所示的探针68p15827组成。

23、优选地，所述探针包括taqman探针和/或杂交探针。

24、优选地，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团，更优选为所述探针的5’端标记有荧光基团、3’端标记有淬灭基团。

25、优选地，所述荧光基团包括cyan500、fam、vic、cy3、joe、tamra、texas red、rox、cy5、cy5.5、tet、hex、ned中的任意一种。

26、优选地，所述淬灭基团包括mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3、nfq、dabcyl、eclipse中的任意一种。

27、第二方面，本发明还提供了上述引物探针组在确定hpv e6/e7癌基因表达情况、检测hpv致癌活动产物或预测宫颈癌病变趋势中应用。

28、第三方面，本发明还提供了一种基于上述引物探针组的宫颈癌筛查试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物探针组。所述试剂盒基于实时荧光定量pcr检测常见高危型(hr)-hpv亚型e6/e7 mrna。

29、优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

30、优选地，所述阳性质控品含有特异性高危型(hr)-hpv亚型e6/e7 rna和/或dna。

31、第四方面，本发明还提供了一种应用上述引物探针组进行宫颈癌早筛和癌变风险评估的检测方法。

32、优选地，所述检测方法为基于核酸扩增的检测手段和/或核酸分子杂交原理的检测方法。

33、优选地，所述检测方法为pcr、数字pcr、交叉引物扩增技术、荧光定量pcr技术、熔解曲线、重复序列标记物的定量荧光多聚酶链反应技术、多重连接依赖性探针扩增、侧向层析试纸条、极限pcr、光pcr、cast pcr、脉冲pcr、巢式pcr、pcr芯片、分子信标核酸检测技术、等温扩增技术中的至少一种。

34、优选地，所述检测方法为应用上述试剂盒对提取的rna样本进行荧光定量pcr来检测分析hpv rna的水平。

35、优选地，所述检测方法用于hpv分型定量检测和/或hpv的单重以及多重感染检测。

36、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

37、（1）本发明提供一种常见高危型(hr)-hpv亚型（包括16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型）hpv e6/e7 mrna的单重以及多重rt-pcr 检测方法及试剂盒，实现对常见高危型(hr)-hpv亚型的快速准确定量。

38、（2）本发明通过大量的数据分析最终确定了常见高危型(hr)-hpv亚型e6/e7 mrna选择性剪切转录本序列以及相应的引物探针，确定了一种宫颈癌检测的新方法。

39、（3）本发明所提供的选择性剪切转录本序列以及相应的引物探针及基于荧光定量pcr技术的诊断方法，克服了现有技术检测手段诊断敏感性较低，假阳性率较高，不能分型等的缺陷。

40、（4）本发明从转录水平及转录后调控着手，提高宫颈癌检出率，简单方便，有较高的敏感性和特异性，可以提示病毒基因的活性状态和癌变的进展程度，是目前筛查宫颈癌变的有效方法。通过本发明的检测方法及试剂盒进行宫颈癌的初筛或自查，实现早发现早治疗，可以使患者的病情得到控制，延长生存期，避免癌症发展。