一种基于液滴微流控和流式细胞仪联用的丝状真菌高通量筛选方法及应用

文档序号:34620046发布日期:2023-06-29 12:25阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于微流控和流式细胞术联用的丝状真菌高通量筛选方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述突变体文库的构建采用常压室温等离子体诱变技术,诱变条件设定为:孢子或原生质体悬液用量为10μl,载片与等离子体发生器射流出口间距为2mm,功率为120w,通气量10slm,诱变时间为150-180s。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述培养基配方为:2%葡萄糖、0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母粉、0.1%nano3、0.05%kh2po4、0.05%mgso4·7h2o、0.001%feso4·7h2o,余量为水。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述培养基中的孢子或原生质体浓度根据泊松分布中的λ值计算获得;所述原生质体需要在高渗条件下预培养3-6h完成再生后再进行包埋。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述静止培养的时间为20-24h。

6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)所述分选的目标产物可以是胞内积累的,也可以是胞外分泌的。

7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)所述富集条件为油相流速为5-10μl/min,液滴流速为1-2μl/min,富集的速率为10000-20000个液滴/h,且富集的阳性效率达到50%以上。

8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(6)所述发酵的培养基配方为:2%葡萄糖、0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母粉、0.1%nano3、0.05%kh2po4、0.05%mgso4·7h2o、0.001%feso4·7h2o;发酵条件为:30℃、220rpm培养24h。

9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(7)所述摇瓶发酵的条件为:30℃、220rpm培养72h。

10.权利要求1-9任意一项所述方法在筛选分泌表达的酶蛋白的高产菌株,或筛选丝状真菌内源的整合位点和启动子,或实现丝状真菌的高通量筛选和高效纯化分离中的应用。


技术总结
本发明公开了一种基于液滴微流控和流式细胞仪联用的丝状真菌高通量筛选方法及应用,属于高通量筛选技术领域。本发明为了解决流式细胞术和微流体技术存在的技术缺陷,建立适应米曲霉等丝状真菌的体外筛选系统,同时加快异核体菌株后续的纯化分离,利用液滴微流控芯片生成均匀稳定的大液滴,为米曲霉孢子提供萌发、生长及产酶的封闭环境,同时将酶活力与荧光信号的强弱偶联,成功实现了高产淀粉酶米曲霉菌株的高通量筛选。此方法操作简便、筛选周期短、筛选效率高,极大地节省了人力、物力,为米曲霉菌的高通量筛选奠定基础。同时,此方法对丝状真菌的高通量筛选同样具有较高的参考价值。

技术研发人员:张国强,陈坚,黎青华,堵国成,余世琴,周景文,李江华
受保护的技术使用者:江南大学
技术研发日:
技术公布日:2024/1/13
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