肿瘤高亲和肽YQP-4及其应用

本发明属于生物工程制药和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及肿瘤靶向肽及其应用，例如可用于肿瘤诊断、术中导航以及肿瘤治疗中。

背景技术：

1、肿瘤己经成为威胁人类健康和生命的罪魁祸首，因此，肿瘤的早期诊断以及肿瘤的有效治疗显得尤为重要并且迫切。对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为b超、ct和mri，这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。不可否认，筛选和优化靶向肿瘤的多肽是一种新的途径，可以为肿瘤的诊断、分期以及手术指导开发新型的分子显像药物，可以发现更微小病灶，达到早期诊断的目的。

2、钙粘素家族是一类介导钙依赖性细胞粘附的跨膜糖蛋白。在功能上，钙粘素介导的粘附作用调节细胞的生长与分化。钙粘素通过与连环蛋白形成复合物，来介导细胞与细胞之间的粘附，维持组织结构的稳定。由于钙粘素在细胞识别、粘附、和信号传递中的重要作用，所以探究钙粘素在癌症发生过程中的表达变化和功能作用具有重要的意义。在多种人类恶性肿瘤组织中能检测到p-钙粘素表达的改变，可见的表达与恶性肿瘤的发生发展息息相关。p-钙粘素在不同类型肿瘤组织中，其对肿瘤的作用也不尽相同。如膀胱、癌结肠癌、乳腺癌和胰腺癌等，p-钙粘素促进肿瘤的发展与转移

3、花菁类染料具有分子量小、毒性低、波长可调范围广、以及摩尔消光系数大等优点，使其广泛地用于荧光标记领域。通过对花菁类染料结构的修饰，使其连接上具有活性的反应基团，然后与特异性靶分子如抗体、蛋白质、短肽、小分子等的氨基或羧基发生反应形成稳定的共价键，形成具有特异性靶向分子探针进行荧光分子活体成像是近红外荧光染料的一个重要用途。单光子发射计算机断层/计算机断层扫描(single-photon emissiontomography/computerized tomography，spect/ct)是近20年来发展起来并在临床上推广的一种新型的核医学显像技术，主要是利用短半衰期放射性核素来标记具有特异性靶向的配体进行示踪显像，可显示活体内物质代谢、细胞增殖、受体分布等信息，用于疾病的诊断和人体生命活动的研究。所以，特异性靶向的配体是荧光成像以及放射性核素显像的关键。

4、基于以上考虑，申请人设计出了一类新型的肿瘤靶向多肽，这类多肽能特异性的靶向肿瘤组织中的p-钙粘素，偶联荧光染料可进行光学成像来协助医生在利用分子影像手术导航设备时可以在术中精确定位肿瘤边界，来达到对肿瘤精准切除的目的，从而减少对病人创伤，降低术后复发的风险。除此之外，该靶向多肽还可偶联放射性核素进行核素成像，来达到肿瘤早期诊断和治疗的目的。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供几种结构新颖，肿瘤特异性靶向的多肽及其序列；

2、本发明的另一目的在于提供几种肿瘤特异性靶向的荧光探针的制备方法；

3、本发明的另一目的在于提供几种肿瘤特异性靶向的放射性探针的制备方法；

4、本发明的再一目的是提供几种所述的探针在光学及spect显像中的应用。

5、本发明的上述目的可通过以下技术方案实现：

6、肿瘤特异性靶向肽，选自以下任意一种：

7、肿瘤靶向肽yqp-1，序列为hyp-ser-asp-asn-tyr-thr-nh2；

8、肿瘤靶向肽yqp-2，序列为glu-nle-gly-hyp-ser-asp-asn-tyr(3-i)-thr-nh2；

9、肿瘤靶向肽yqp-3，序列为hyp-ser-asp-asn-tyr(3-i)-thr-nh2；

10、肿瘤靶向肽yqp-4，序列为glu-ile-asp-pro-ser-asp-asn-tyr-thr-tyr-tyr-asn-gln-asn-phe-lys-gly；

11、肿瘤靶向肽yqp-5，序列为cys-pro-ser-asp-asn-tyr-thr-cys 1-7，二硫键环；

12、肿瘤靶向肽yqp-6，序列为phe-thr-ala-tyr-asn-gly-tyr-tyr-asp-gly-gly-phe-nh2。

13、其中：hyp为羟脯氨酸，tyr(3-i)为碘代酪氨酸，nle为正亮氨酸。

14、本发明所述的肿瘤靶向肽yqp-x(x＝1-6)可以委托生物公司合成，也可以通过本领域常规技术手段制备。

15、多肽yqp-1的固相合成方法如下：

16、1)树脂溶胀

17、称取rinkamide mbha树脂，放入反应柱，加入适量的二氯甲烷(dcm)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分膨胀开来。抽掉dcm溶液，用dmf洗涤3遍，抽干。

18、2)脱除fmoc

19、反应柱中加入20％的六氢吡啶dmf溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后用dmf洗涤6遍。

20、3)偶联

21、准确称取投料树脂摩尔数3倍的fmoc-thr(trt)-oh与o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)，完全溶于dmf中，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)使羧基活化，然后将溶液加入反应柱进行反应，1h后检测，检测结构呈阳性即可。依次按照顺序从c端向n端偶联脱除fmoc，直至偶联完最后一个氨基酸fmoc-hyp-oh，然后脱除fmoc后，再将目标树脂肽收缩，称重。

22、4)裂解

23、配制87.5％tfa+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水的裂解液，在低温条件下，将裂解液缓慢加入树脂肽中，切割液体积按照粗肽树脂重量的7-8倍，缓慢搅拌2h后，抽滤得液体，加入冰乙醚搅拌，然后离心得固体，用乙醚洗涤三遍，抽干称重并且测定质荷比，确定分子量。

24、5)纯化分离

25、采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％tfa/水溶液-0.1％tfa/乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目的肽浓缩液，然后冻干得目的多肽。

26、环状多肽yqp-5的制备方法如下：

27、1)树脂溶胀

28、称取fmoc-cys(trt)-2chlorotrityl resin树脂，放入反应柱，加入适量的二氯甲烷(dcm)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分膨胀开来。抽掉dcm溶液，用dmf洗涤3遍，抽干。

29、2)脱除fmoc

30、反应柱中加入20％的六氢吡啶dmf溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后用dmf洗涤6遍。

31、3)偶联

32、准确称取投料树脂摩尔数3倍的fmoc-cys(trt)-oh与o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)，完全溶于dmf中，加入diea使羧基活化，然后将溶液加入反应柱进行反应，1h后检测，检测结构呈阳性即可。依次按照顺序从c端向n端偶联脱除fmoc，直至偶联完最后一个氨基酸fmoc-cys(trt)-oh，然后脱除fmoc后，再将目标树脂肽收缩，称重。

33、4)裂解

34、配制87.5％tfa+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水的裂解液，在低温条件下，将裂解液缓慢加入树脂肽中，切割液体积按照粗肽树脂重量的7-8倍，缓慢搅拌2h后，抽滤得液体，加入冰乙醚搅拌，然后离心得固体，用乙醚洗涤三遍，抽干称重并且测定质荷比，确定分子量为。

35、5)二硫键成环

36、将样品溶于纯水中进行搅拌，调节ph，使多肽水溶液呈弱碱性，加入双氧水，反应0.5h后进行检测，检测结果呈阳性即可，调节多肽溶液ph，使之呈酸性。

37、6)纯化分离

38、采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％tfa/水溶液-0.1％tfa/乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取环化好后的溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目的肽浓缩液，然后冻干得目的多肽。

39、本发明所述的肿瘤特异性靶向肽或其二聚体、多聚体在制备肿瘤诊断试剂或肿瘤治疗药物中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。

40、一种荧光分子影像探针，具备以下通式：

41、m-l-r，

42、其中，m表示光标记，所述的光标记选自近红外荧光染料、有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子；

43、l为连接基团，l优选aca、peg4、peg6、g6中的任意一种；

44、

45、r为权利要求1所述的任意一个肿瘤特异性靶向肽或其二聚体、多聚体。

46、所述的荧光分子影像探针优选其结构通式如下式所示：

47、

48、其结构中含有用于靶向肿瘤的多肽r和用于光学成像的近红外荧光染料结构mpa(上述左侧结构)以及起到增加靶向多肽与近红外荧光染料之间的距离并调节体内药代动力学特性的连接基团l。

49、本发明还提供了制备所述多肽荧光探针的方法，包括：

50、1)近红外荧光染料mpa的合成

51、将冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮和醋酸钠混合反应，纯化后得产物2，2，3-三甲基[3h]-吲哚-5-磺酸；再将邻二氯苯加入到2，2，3-三甲基[3h]-吲哚-5-磺酸与1，3-丙磺酸内脂的混合物中，制得2，2，3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3h]-吲哚；再将该产物与n-[(3-(anilinomethylene)-2-chl oro-1-cyclohexen-1-yl)methylene]-anilinemonohydrochloride反应得到绿色碳菁染料，最后将碳菁染料与巯基丙酸及三乙胺反应，制备液相分离纯化得水溶性近红外染料mpa。

52、2)mpa-l-yqp-x(x＝1-6)的合成

53、将分离纯化得到的近红外染料mpa与l-yqp-x(x＝1-6)多肽溶于二甲基亚砜中，加入适量的n,n-二异丙基乙胺(dipea)，室温反应过夜，反应完成后经制备液相纯化分离得到目标荧光化合物。其中，l-yqp-x可以委托生物公司固相合成。

54、一种放射性核素探针，其特征在于为放射性核素标记的权利要求1所述的肿瘤特异性靶向肽或其二聚体多肽；所述的放射性核素优选自125i、131i、18f、99mtc、68ga，64cu，67ga，90y，111in或177lu。

55、作为本发明的一种优选，本发明进一步提供一种放射性核素探针，它是放射性核素标记的多肽配合物，多肽yqp-x(x＝1-6)结构中，包含有酪氨酸，其中酚羟基的邻位可以通过亲电取代反应进行放射性碘标记(125i/131i)，此外，选用18f对多肽进行多肽yqp-x(x＝1-6)标记，选用不同的核素多分子进行标记，用于疾病的诊断或治疗。结构式如(ⅱ)所示

56、

57、作为本发明的另一种优选，本发明进一步提供另一种放射性核素探针，它是放射性核素锝标记的多肽或二聚体多肽，结构式如(iv)所示，此外，

58、

59、其结构中含有用于靶向肿瘤的多肽yqp-x(x＝1-6)或二聚体多肽、用于放射性标记的双功能螯合剂6-肼基吡啶-3-甲酸(hynic)，放射性核素配体n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和三苯基膦三间磺酸钠盐(tppts)、以及放射性核素及连接基团。连接基团可以选自谷氨酸两个羧基连接两分子连接基团l所组成的连接支架(l2e)或赖氨酸的羧基和氨基连接两分子连接基团l所组成的连接支架(l2k)，或者起到增加靶向多肽与放射性核素配体n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和三苯基膦三间磺酸钠盐(tppts)之间距离并调节体内药代动力学特性的连接基团l，l选自aca、peg4、peg6、g6。

60、其中，通过对双功能螯合剂的改变，比如替换成双功能螯合剂dota，nota或dtpa，放射性核素可选除99mtc之外的其他放射性核素，比如68ga，64cu，67ga，90y，111in或177lu用于疾病的诊断或治疗，结构式如(ⅷ)所示。m代表核素，l选自aca、peg4、peg6、g6。

61、

62、本发明还提供了制备所述放射性核素探针制备的方法，包括：

63、1)hynic-nhs的合成

64、将6-氯烟酸和80％水合肼加入到乙醇中，加热回流反应，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调ph＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体，产品经esi-ms质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基亚砜(dmso)中，加热反应5-6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤得固体，此固体烘干后与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)以及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)一起加入到dmso中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后经esi-ms质谱和核磁氢谱确定为目标产物。

65、2)hynic-aca-yqp-1的合成

66、将纯化的中间体hynic-nhs溶于dmso中，然后加入2摩尔量的edci和2摩尔量的nhs，室温反应5小时，用分析型高效液相检测反应进程，反应完成后加入2摩尔量的靶向肽yqp-x，然后再加入4摩尔量的dipea，室温反应3小时，反应完成后通过制备液相进行分离纯化并通过质谱确证。

67、3)放射性探针99mtc-hynic-aca-yqp-1的合成

68、分别配制浓度为100.0mg/ml的tppts(三苯基磷三间磺酸钠)溶液，浓度为130.0mg/ml的tricine(三甲基甘氨酸)，浓度为102.4mg/ml丁二酸-丁二酸钠缓冲液(其中丁二酸77.0mg，丁二酸钠25.4mg)，分别取10.0ul tppts溶液，10.0ul tricine溶液，10.0ul丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和10.0ul(1.0mg/ml)所述(yqp-x)2-l2e-hynic混合于西林瓶中，然后加入10mci na 99mtco4于100℃金属浴加热20分钟，待反应结束后冷却至室温，分别制成多肽放射性药物，产品经agilent zorbax sb-aq分析柱分析鉴定。

69、本发明所述的荧光分子影像探针、本发明所述的放射性核素探针在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂、靶向型基因治疗或化疗药物中的应用。

70、本发明所述的多肽化合物可特异性靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的摄取和滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂以及放射性核素显像剂及治疗剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。

71、本发明所述的新型多肽及以此系列多肽构建的荧光以及放射性核素探针与现有技术相比的有益效果为：

72、1、本发明发现的yqp-x系列多肽是低分子量多肽，合成成本低廉，并且此系列短肽有三个氨基酸是经修饰的非天然氨基酸，非天然氨基酸的引入可极大地提高此系列多肽在活体内的稳定性，不易在体内被降解，靶向活性不易被破坏，有更强的潜力靶向至靶部位，体内外实验结果表明了此系列探针在体内外具有优异的稳定性以及靶向性，稳定性的增强会促进此系列的影像探针在肿瘤部位的浓聚和滞留，进而达到更好的肿瘤显像效果，使得更加有利于在临床上推广应用。

73、2、yqp-x系列多肽经体内光学和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌以及肝癌，能特异性靶向肿瘤部位的性质将有可能实现对恶性肿瘤的核医学诊断、治疗以及光学成像指导外科医生进行手术导航，达到对病灶的精准切除。

74、3、本发明中使用了稳定性以及水溶性更理想的近红外荧光染料mpa作为光学显像基团，改善了药物在体内的药代动力学。

75、4、本发明中引入了多个水溶性的peg4或peg6分子，以进一步改善药代动力学特性，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。

76、5、本发明中使用hynic作为双功能螯合剂，同时使用tricine和tppts作为协同配体从而使“99mtc-hynic核”具有更好的体内外稳定性。

77、以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。