经改变的耐热性DNA聚合酶的制作方法

本发明涉及聚合酶链反应(pcr)等中使用的耐热性dna聚合酶的突变体。进而涉及使用该耐热性dna聚合酶的核酸扩增方法。本发明不仅可以用于研究领域，还可以用于临床诊断、环境检查等。

背景技术：

1、核酸扩增法是将数个拷贝的靶核酸扩增到可见的水平、即数亿拷贝以上的技术，不仅用于生命科学研究领域，也广泛用于基因诊断、临床检查之类的医疗领域、或者食品和环境中的微生物检查等中。

2、有代表性的核酸扩增法是pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)。pcr是如下方法：以(1)利用热处理进行的dna变性(由双链dna解离为单链dna)、(2)引物与模板单链dna的退火、(3)使用dna聚合酶使上述引物延伸这3个步骤为1个循环，通过重复进行该循环来扩增试样中的靶核酸。

3、在检测对象核酸为rna时，例如，在病原性微生物的检测中对象为rna病毒时、或通过定量mrna来测定基因的表达量时等，广泛使用rt-pcr，所述rt-pcr在pcr之前进行利用逆转录酶将rna转换为cdna的反应(逆转录反应)。

4、已知这些核酸扩增法会由于生物试样中存在的糖、蛋白质等抑制物质而受到强烈抑制，扩增效率、检测灵敏度会下降，在上述核酸扩增之前，需要进行从生物试样中提取并纯化核酸的操作。

5、作为从生物试样提取核酸的核酸提取法，已知使用苯酚、氯仿等有机溶剂的方法(专利文献1)，但是即使使用这些方法进行试样中的核酸的纯化，也难以彻底除去杂质，试样中的核酸的回收量通常不稳定，特别是当试样中的核酸含量少时，有时难以进行核酸扩增。

6、另外，核酸扩增法的反应需要时间，这也是一个问题。通常，在pcr反应中需要根据靶核酸的大小来改变延伸时间，多数情况下每1kb设定为1分钟左右，靶核酸较长时，有时反应时间会超过2～3小时。另外，关于逆转录的反应时间，通常也需要20分钟左右。

7、综上，需要进一步改善反应体系，需要对抑制物质的耐受性强、可以以更短的时间实施反应的核酸扩增法。

8、实际上，为了提高反应效率，正在对dna聚合酶的改良进行研究(专利文献2～4、非专利文献1～3)。在专利文献2中，通过向pcr中通常使用的taq dna聚合酶中导入突变，成功取得了耐受盐等的抑制的强的改变型dna聚合酶。另外，同样地，专利文献3及非专利文献1～3中通过向taq dna聚合酶中引入突变而取得了耐受血液、抑制的强的改变型dna聚合酶。

9、但是，这种突变体的制作止步于向最通用的taq dna聚合酶中引入突变，并未对其它的dna聚合酶实施。另外，虽然也公开了耐受杂质强的抑制的例子，但是关于反应时间的缩短则没有言及。

10、taq dna聚合酶的逆转录活性弱，不能用于rt-pcr中。另外，这些taq dna聚合酶突变体中，也偶然出现不足以高效实施反应的例子，因此需要性能更高的dna聚合酶。

11、现有技术文献

12、专利文献

13、专利文献1：日本特开平9-19292号公报

14、专利文献2：日本专利第5809059号公报

15、专利文献3：日本专利第5852650号公报

16、专利文献4：日本专利第5189101号公报

17、非专利文献

18、非专利文献1：original researcharticle(2014年8月14日发行)

19、非专利文献2：nucleic acids research,vol.37,no.5e40(2009年发行)

20、非专利文献3：original researcharticle(2014年9月3日发行)

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、在核酸扩增法、特别是pcr、rt-pcr中，需要对抑制物质的耐受性强、另外可以缩短pcr反应时间的dna聚合酶。

3、用于解决问题的方案

4、本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，通过对具有逆转录活性的dna聚合酶引入突变，从而与现有的taq dna聚合酶、在相同位置具有突变的taq dna聚合酶突变体相比，可以强地耐受抑制物质且大幅缩短反应时间。另外发现，由于使用具有逆转录活性的dna聚合酶，因此在以往无法应对的rt-pcr中也可以应用该改变型dna聚合酶，从而完成了本发明。

5、即，本发明的概要如下所示。

6、项1.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同一性的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

7、项2.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号1的氨基酸序列具有96％以上的同一性的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

8、项3.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且具有序列号1的氨基酸序列的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

9、项4.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号2的氨基酸序列具有90％以上的同一性的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

10、项5.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号2的氨基酸序列具有96％以上的同一性的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

11、项6.一种dna聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且具有序列号2的氨基酸序列的dna聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。

12、项7.根据项1～6中任一项所述的dna聚合酶，其中，与序列号1或序列号2中的第509位或第744位相当的氨基酸的改变是置换为选自由组氨酸、赖氨酸及精氨酸组成的组中的任一氨基酸。

13、项8.根据项7所述的dna聚合酶，其中，与序列号1或序列号2中的第509位相当的氨基酸的改变是置换为精氨酸。

14、项9.根据项1～8中任一项所述的dna聚合酶，其中，逆转录反应在5分钟以下完成。

15、项10.根据项9所述的dna聚合酶，其中，逆转录反应在1分钟以下完成。

16、项11.根据项1～10中任一项所述的dna聚合酶，其中，每1kb的延伸时间为30秒以下。

17、项12.一种核酸扩增方法，其特征在于，使用项1～11中任一项所述的dna聚合酶对未经过纯化工序的生物试样进行扩增。

18、项13.根据项12所述的核酸扩增方法，其中，所述生物试样为选自由源自血液的试样、唾液、脊髓液、尿及乳汁组成的组中的至少1种试样。

19、发明的效果

20、通过使用本发明的dna聚合酶，可以不受杂质的影响且以短反应时间进行核酸扩增。可以省略除去杂质的纯化工序，因此可以大幅缩短处理时间。