新型冠状病毒SARS-CoV-2广谱中和单域抗体及其应用

本发明属于生物工程纳米，涉及新型冠状病毒sars-cov-2突变株广谱中和抗体及应用。具体涉及一种有效抑制新型冠状病毒sars-cov-2突变株的单域抗体制备及其临床应用。

背景技术：

1、抗体(antibody，ab)是由效应淋巴b细胞分泌，结构呈“y”字型的、机体用于抵御外来物质的一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)。中和作用(neutralization)是指抗体与特定的抗原结合产生沉淀或者细胞集团，然后被吞噬细胞吞噬。中和抗体是b淋巴细胞产生的能够与病原微生物表面抗原结合的一类抗体，是特异针对病毒中和表位产生的抗体，可直接靶定到病毒中和表位，使病毒失去结合受体的能力，可有效清除胞外病原体(大部分细菌)和处于裂解复制期的游离病毒。中和抗体通过与新冠病毒的s蛋白结合，可以有效阻止新冠病毒感染细胞，还可以用于治疗新冠患者，同时也能够作为预防性疗法，给易感高危人群提供被动免疫能力。理想的疫苗应诱导出能够中和绝大多数甚至所有正在传播的此类病毒家族的抗体，这样的抗体被称为广谱中和抗体(broadlyneutralizing antibody，bnab)。bnab可通过靶向高度保守并暴露于可变病毒表面蛋白上的表位来发挥功能。目前针对新冠病毒感染治疗，早期采取抗病毒治疗，而抗病毒治疗的核心就是广谱中和抗体。

2、基于骆驼科动物纳米抗体(nanobody，nb)，是病毒中和抗体的候选对象。纳米抗体是已知的能与抗原稳定结合的最小功能性单域抗体，具有结构功能上的独特优势。单域抗体的分子量只有约13-15kda，直径约为2.5nm，长4nm，是迄今为止最小的具有抗原结合功能的抗体片段，其与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致或具有更高的特异性抗原亲和力。与传统igg类常规抗体相比，单域抗体具有诸多优势：(1)其相对分子质量小，可识别传统抗体因空间位阻不能结合的抗原表位，新冠病毒s蛋白糖基化密布，小分子单域抗体更易结合少许裸露的rbd结合区域；(2)没有fc结构域，可以有效避免抗体依赖性增强效应(ade)；(3)水溶性和稳定性更好，可放入口罩、甚至公共区域的中央空调系统，预防新冠病毒；(4)更易于进行蛋白工程化设计，可以低成本大规模生产；(5)组织穿透性更强。单域抗体的研究和开发在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。

3、新型冠状病毒(sars-cov-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2)为β冠状病毒属成员，为新发病原体，与sars-cov基因组的同源性约为80％。sars-cov-2病毒在体外可以感染多种细胞，包括vero-e6，huh7，calu-3，以及分化的人呼吸道上皮细胞等。

4、sars-cov-2是具有包膜的单股正链rna病毒，病毒颗粒直径约为80～140nm，主要有5种结构蛋白，分别是刺突糖蛋白(spike，s)、糖蛋白小衣壳(envelope，e)、膜糖蛋白(membrane，m)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，n)。其中，表面刺突s蛋白在冠状病毒感染靶细胞过程中发挥重要的作用。s蛋白作为新冠病毒表面重要的受体结合位点，与细胞表面病毒特异性受体结合，介导病毒外膜与细胞融合，病毒穿膜释放核酸合成新的病毒，引起细胞病变和死亡，从而引发组织器官病变。研究表明，冠状病毒s蛋白受体结合域(receptorbinding domain，rbd)在病毒与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2(angiotensinconverting enzyme 2，ace2)结合、入侵宿主细胞过程中起到至关重要的作用。因此，sars-cov-2病毒的rbd结构决定了其与潜在受体ace2结合的效率以及感染的种属特异性，是重要的中和抗体识别与开发靶点。

5、sars-cov-2是一种rna病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异。一旦出现一种适应性好的变异株，则可能引起广泛传播。随着sars-cov-2病毒的传播时间的不断延长，越来越多的突变株随之产生，已出现成百上千的突变位点。sars-cov-2突变株可导致传播加速和致病力改变等，另外一个直接后果就是导致疫苗的保护性下降、早期研发的一些单克隆抗体药物失效或中和能力大大降低。

6、鉴于此，针对sars-cov-2变异株研发可用于临床治疗的广谱中和抗体，对于疾病的临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和广泛的应用前景。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效抑制多种新型冠状病毒sars-cov-2突变株活性的广谱中和单域抗体的制备及其应用。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了特异性结合sars-cov-2刺突蛋白的单域抗体，所述单域抗体包括重链可变区(vhh)，所述重链可变区包括互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，氨基酸序列分别如下：

3、互补决定区cdr1：qytyrrfc；

4、互补决定区cdr2：ldssgft；

5、互补决定区cdr3：aadtsgwaclpcseegkycsgtaeqydv。

6、即包括氨基酸序列分别如seq id no.1所示的第26-33位的互补决定区cdr1、如seq id no.1所示的第51-57位的互补决定区cdr2和如seq id no.1所示的第96-123位的互补决定区cdr3。

7、所述单域抗体可为特异性结合sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)受体结合区(receptor binding domain，rbd)的广谱中和单域抗体。所述单域抗体由重链可变区组成，又称为vhh抗体。

8、进一步地，本发明所述单域抗体还包括框架区。

9、所述单域抗体b11的框架区fr1的氨基酸序列如seq id no.1的第1-25位所示；fr2的氨基酸序列如seq id no.1的第34-50位所示；fr3的氨基酸序列如seq id no.1的第58-95位所示；fr4的氨基酸序列如seq id no.1的第124-134位所示。

10、上述单域抗体中，所述重链可变区的氨基酸序列可如seq id no.1所示。

11、本发明还提供了与所述单域抗体相关的生物材料，所述生物材料为以下的任意一种：

12、(1)编码所述单域抗体重链可变区的核酸分子；

13、(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；

14、(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体、或含有(2)所述表达盒的重组载体；

15、(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(2)所述表达盒的重组微生物、或含有(3)所述重组载体的重组微生物；

16、(5)含有(1)所述核酸分子的细胞系、或含有(2)所述表达盒的细胞系、或含有(3)所述重组载体的细胞系。

17、其中，(4)所述的重组微生物和(5)所述的细胞系可表达所述单域抗体。

18、上述生物材料中，所述核酸分子为核苷酸序列如seq id no.2所示的dna分子。

19、seq id no.2所示的dna分子编码seq id no.1所示的单域抗体b11。

20、具有改善的亲和力和/或效价的本发明所述单域抗体的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。

21、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒等)。在本发明的一个实施例中，载体具体可为pmecs。

22、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽胞杆菌属(bacillus)等。在本发明的一个实施例中，微生物具体可为大肠杆菌wk6。

23、所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞。

24、在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为pmecs-b 11。

25、所述重组载体pmecs-b11是采用b11的dna分子替换原核表达载体pmecs的psti和noti之间的dna分子，得到表达单域抗体b11(与组氨酸标签融合)的重组原核表达载体pmecs-b11。b11的dna分子是在seq id no.2的3′末端(seq id no.2的第402位)添加了noti识别位点(编码序列为gcggccgc)和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)，保持如seq id no.2的其它核苷酸序列不变得到的dna分子。

26、在本发明的一个实施例中，所述重组微生物(重组菌)具体可为wk6/pmecs-b11。

27、重组微生物wk6/pmecs-b11含有seq id no.2所示的dna分子，表达氨基酸序列是seq id no.1的单域抗体b11。所述重组微生物wk6/pmecs-b11是将所述重组载体pmecs-b11电转大肠杆菌wk6得到的重组菌。

28、本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有所述单域抗体和药学上可接受的载体。

29、所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

30、其中，所述药物组合物具有抑制或中和sars-cov-2活性的中和抗病毒作用。所述药物组合物用于改善、预防或治疗sars-cov-2感染引起的疾病和/或用于抑制sars-cov-2感染。

31、进一步地，本发明的药物组合物包含第一抗体和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体为本发明的单域抗体，而第二抗体为中和sars-cov-2病毒感染的任何抗体或其抗原结合片段。

32、本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备抑制或中和sars-cov-2活性的药物中的应用。

33、所述抑制或中和sars-cov-2活性包括特异性结合sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)rbd区域，从而使sars-cov-2失去结合受体ace2的能力。

34、上述应用中，所述抑制或中和sars-cov-2活性的药物可用于改善、预防或治疗sars-cov-2感染引起的疾病和/或用于抑制sars-cov-2感染。

35、本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备用于检测sars-cov-2水平和/或sars-cov-2的刺突蛋白的产品中的应用。

36、本发明的单域抗体通过检测抗sars-cov-2疫苗的抗原是否含有具有正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量的用途也设想处于本发明的范围内。

37、所述用于检测sars-cov-2水平和/或sars-cov-2的刺突蛋白的产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法或免疫比浊法等检测抗原抗体结合的产品。

38、本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备用于诊断或辅助诊断sars-cov-2感染引起的疾病的产品中的应用。

39、上述应用中，所述sars-cov-2感染引起的疾病可为呼吸系统感染。所述呼吸系统感染可为呼吸道感染和/或肺部感染。

40、上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。

41、所述试剂或试剂盒含有本文任一所述单域抗体或其组合。所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。

42、本文中，术语“特异性结合sars-cov-2刺突蛋白的单域抗体”和“抗rbd单域抗体”具有相同的含义，可互换使用。

43、本文中，术语“中和抗体”是指一种能中和，即防止、抑制、减小、阻碍或干扰病原体引发和/或保持宿主内感染的能力的抗体。如本文所述，这些抗体可单独地或以组合形式，在经适当配制后用作预防剂或治疗剂，与活性疫苗接种联合使用，用作诊断工具或用作生产工具。

44、在一个实施例中，本发明的单域抗体能够中和sars-cov-2多种突变株的假病毒。示例性sars-cov-2突变株包括但不限于delta突变株和omicron突变株。

45、本发明利用噬菌体抗体库技术，经过多轮筛选富集具有rbd蛋白抗原特异性的噬菌体，并鉴定获得阳性克隆，通过测序得到的相应的编码序列，并在大肠杆菌wk6中表达并纯化，成功获得了特异性结合sars-cov-2刺突蛋白受体结合区的广谱单域抗体b11。本发明的单域抗体b11对sars-cov-2抗原(rbd蛋白)亲和力高，能通过特异性结合sars-cov-2刺突蛋白rbd区域来抑制或中和sars-cov-2活性，使sars-cov-2失去结合受体ace2的能力。同时，本发明的单域抗体对sars-cov-2主要流行株(delta突变株和omicron突变株)有明显的抑制作用，对sars-cov-2假病毒具有较强的抑制活性和中和活性，具有抑制多种突变株sars-cov-2假病毒感染的能力，是具有广谱作用的中和抗体，广谱性和中和活性好。本发明的单域抗体可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产，获得具有中和sars-cov-2感染的抗体产物，或可制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒感染的特异性抗体药物，或sars-cov-2的诊断试剂或诊断试剂盒等，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。