高表达gstA基因质粒、其构建方法、含高表达gstA基因质粒的曲霉工程菌株及其构建方法与应用

本申请属于生物工程，尤其涉及一种高表达gsta基因质粒、含高表达gsta基因质粒的曲霉工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、曲霉属微生物是一种遗传性状稳定并耐高温/高渗透压的真菌微生物，由于能够表达水解生物质的酶，从而可以实现木质纤维素等廉价生物质资源的高值化转化；同时，曲霉属微生物具有较好的底物和/或ph适应性，工业上已经实现了生产α-淀粉酶、柠檬酸等开发应用，研究前景十分良好。

2、目前，针对曲霉属微生物的研究开发大都集中于提高菌种产量、增强产品风味以及新用途的开发利用等方面，极大促进了曲霉属微生物的工业应用。

3、但是，曲霉属微生物的发酵生产中往往需要快速地提高生物量，而现有技术中鲜有针对缩短曲霉菌株发酵时间的研究报道，使得曲霉菌株的发酵效率较低，从而极大限制曲霉属微生物在发酵生产方面的实际应用。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种高表达gsta基因质粒、其构建方法和应用，旨在解决现有曲霉菌株发酵周期长、发酵效率低的技术问题。

2、为了实现上述目的，本申请的技术方案是：

3、本申请的第一方面提供一种高表达gsta基因质粒的构建方法，所述方法包括：

4、利用引物zero-gsta-f/gpd-gsta-r从原始曲霉菌株的基因组中pcr扩增获得gsta基因片段，其中，所述gsta基因的基因id为aspnidraft2_1141004；所述zero-gsta-f的核苷酸序列为seq id no.2所示；所述gpd-gsta-r的核苷酸序列为seq id no.3所示；

5、利用引物heigpd-f/l-zero-r对合成载体peasy-cre-loxp-gpd进行pcr扩增获得线性化质粒载体，其中，所述合成载体peasy-cre-loxp-gpd含有hph基因片段和启动子pgpda；

6、所述heigpd-f的核苷酸序列为seq id no.9所示；

7、利用克隆试剂盒将所述gsta基因片段与所述线性化质粒载体进行连接，并将所得产物转化至dh5α感受态细胞之后，接种于含有氨苄青霉素的lb培养基中培养，挑取单克隆并利用引物zero-gsta-f/heigpd-seq-f进行菌落pcr验证以及引物hgpd-seq-f对菌落pcr验证正确的质粒进行测序，得到高表达gsta基因质粒，其中，所述heigpd-seq-f的核苷酸序列为seq id no.10所示；所述hgpd-seq-f的核苷酸序列为seq id no.11所示。

8、在第一方面可选的实现方式中，所述合成载体peasy-cre-loxp-gpd的构建方法包括：

9、将元件loxp-hph-loxp的基因序列连接到载体peasy-blunt zero cloningvector，得到质粒peasy-cre-loxp-hph；

10、利用引物zero-heigpd-f/zero-heigpd-r从原始曲霉菌株基因组中pcr扩增获得3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子pgpda，其中，所述pgpda的核苷酸序列为seq id no.4所示；所述zero-heigpd-f的核苷酸序列为seq id no.5所示；所述zero-heigpd-r的核苷酸序列为seq id no.6所示；

11、利用引物zero-up/l-zero-r从所述质粒peasy-cre-loxp-hph模板中pcr扩增获得载体zero-cre-loxp-hph-loxp，其中，所述zero-up的核苷酸序列为seq id no.7所示；所述l-zero-r的核苷酸序列为seq id no.8所示；

12、将所述启动子pgpda与所述载体zero-cre-loxp-hph-loxp进行连接，即得含有hph基因片段和启动子pgpda的合成载体peasy-cre-loxp-hph-pgpd。

13、在第一方面可选的实现方式中，所述lb培养基的组成为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l和nacl 10g/l；ph调至7.0-7.2。

14、本申请的第二方面提供第一方面所述方法构建成的高表达gsta基因质粒。

15、本申请的第三方面还提供一种发酵时间缩短的曲霉工程菌株，所述曲霉工程菌株含有第一方面所述方法构建成的高表达gsta基因质粒。

16、本申请的第四方面还提供第三方面所述曲霉工程菌株的构建方法，所述方法包括：

17、将所述高表达gsta基因质粒转入曲霉菌株，并经转化子筛选，即得。

18、在第四方面可选的实现方式中，所述曲霉菌株为黑曲霉菌株。

19、本申请的第五方面还提供第四方面所述方法构建的曲霉工程菌株在进行液态发酵培养中的应用。

20、在第五方面可选的实现方式中，所述进行液态发酵培养的方法包括：

21、将曲霉工程菌株接种于pda固体培养基中培养至产生分生孢子之后，依次进行种子培养和发酵培养，并将发酵培养所得培养液进行离心分离，即可得到缩短发酵时间的曲霉工程菌株。

22、在第五方面可选的实现方式中，进行所述种子培养的种子培养基组成为：

23、葡萄糖40g/l；细菌蛋白胨6g/l；kh2po40.75g/l；k2hpo40.75g/l；mgso4·7h2o0.1g/l；cacl2·2h2o 0.1g/l；feso4·7h2o 5mg/l；nacl 5mg/l；无水柠檬酸1mg/l；

24、在第五方面可选的实现方式中，进行所述发酵培养的发酵培养基组成为：

25、葡萄糖100g/l；细菌蛋白胨6g/l；kh2po40.15g/l；k2hpo40.15g/l；mgso4·7h2o0.1g/l；cacl2·h2o 0.1g/l；caco380g/l；feso4·7h2o 5mg/l；nacl 5mg/l，无水柠檬酸1mg/l。

26、与现有技术相比，本申请的优点或有益效果至少包括：

27、本申请第一方面提供的高表达gsta基因质粒的构建方法，通过以合成载体peasy-cre-loxp-gpd为模板经pcr扩增获得线性化质粒载体之后，利用克隆试剂盒将该线性化质粒载体与gsta基因片段连接，并将连接产物转化至dh5α感受态细胞中实施培养克隆以及验证、测序等操作，从而得到代谢途径产生特异性定向改造的高表达gsta基因质粒。其中，该高表达gsta基因质粒可以通过曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子(pgpda)控制谷胱甘肽巯基转移酶a基因(gsta)的高表达，从而使得含有高表达gsta基因质粒的曲霉菌株能够在发酵培养中大幅增加糖耗速率，使得发酵周期缩短至96h，为工业生产提供发酵效率提高的优良菌种。

技术特征：

1.一种高表达gsta基因质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述合成载体peasy-cre-loxp-gpd的构建方法包括：

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述lb培养基的组成为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l和nacl10g/l；ph调至7.0-7.2。

4.根据权利要求1-3任一所述方法构建的高表达gsta基因质粒。

5.一种发酵时间缩短的黑曲霉工程菌株，其特征在于，含有权利要求4所述高表达gsta基因质粒。

6.根据权利要求5所述发酵时间缩短的曲霉工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述曲霉菌株为黑曲霉菌株。

8.一种根据权利要求6所述方法构建的曲霉工程菌株在进行液态发酵培养中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述进行液态发酵培养的方法包括：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，进行所述种子培养的种子培养基组成为：

技术总结
本申请公开了一种高表达gstA基因质粒、其构建方法、含高表达gstA基因质粒的曲霉工程菌株及其构建方法与应用，属于生物工程领域。本申请高表达gstA基因质粒的构建方法包括：从曲霉菌株的基因组扩增gstA基因片段，并利用引物heigpd‑F/L‑Zero‑R扩增合成载体pEASY‑Cre‑LoxP‑gpd获得线性化质粒载体；将gstA基因片段与线性化质粒载体连接，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞培养，挑取单克隆并经菌落PCR验证及测序。本申请高表达gstA基因质粒能够通过PgpdA控制gstA高表达，从而可以使含有高表达gstA基因质粒的曲霉工程菌株能够在发酵培养中大幅增加糖耗速率，显著缩短发酵周期。

技术研发人员：黄和,张婷婷,张驰,徐晴,薛锋
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15