利用非洲哈茨木霉防治藜麦真菌病害及促进藜麦生长的方法

本发明属于藜麦真菌病害的防治领域，具体涉及一种利用非洲哈茨木霉( trichoderma afroharzianum) 防治藜麦真菌病害及提早藜麦种子的萌发、促进根系发育、增强根系活力的方法。

背景技术：

1、藜麦为小粒杂粮，种子营养有限，常规种植中不出苗、出苗不齐、幼苗弱小等技术难题经常发生。加之，藜麦属浅根系植物，出苗后植株幼小、根系不发达，易形成弱苗。生产中影响藜麦品质和产量的另一重要因素是真菌性病害。当前，藜麦真菌性病害呈逐年加重趋势，主要原因是病原真菌群体基数积累较多，导致病害易大面积发生；较重的有叶斑病、穗腐病、黑茎病、灰霉病等，产量损失约10% ~ 30%的，严重时损失80%以上。然而，藜麦属于小宗作物，可用的防治方法有限，实际生产中面临着“无标可以、无药可用”的难题。因此，寻求对环境友好且高效的防治方法迫在眉睫。

2、非洲哈茨木霉( trichoderma afroharzianum) 是因其具有显著的营养竞争、重寄生等作用，可使病菌停止生长或侵染，而被作为生防菌应用。但是，实际应用中存在不同来源的非洲哈茨木霉的菌株产孢能力、次生代谢物、培养条件等千差万别，防治效果参差不齐、壮苗效果不明显，针对不同作物其促生和防病方法不能一概而论等诸多技术难题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种利用非洲哈茨木霉防治藜麦真菌病害和促进藜麦种子提早萌发、有效促进根系发育、增强根系活力的方法。

2、本发明筛选获得的生防菌为藜麦种子内生的非洲哈茨木霉（ trichoderma  afroharzianum）lmns-m9，本菌株已于2023年3月10日在中国普通微生物菌种保藏管理中心（机构简称cgmcc）保藏，保藏编号为cgmcc no.40523，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

3、所述的非洲哈茨木霉（ trichoderma afroharzianum）lmns-m9于2021年9月在山西省忻州市静乐县娑婆乡娑婆村藜麦种植区采集成熟的藜麦穗，从其种子中分离筛选获得的。

4、所述的非洲哈茨木霉lmns-m9的产孢簇黄绿色，分生孢子梗呈金字塔形、主轴锐角或直角分支、末端多轮生3个 ~ 4个瓶梗，瓶梗烧瓶状，分生孢子球形至卵圆形；分生孢子梗平均大小9.3×2.9 μm，分生孢子大小平均4.1×2.9 μm（图1-4）。以tef1基因序列构建系统发育树，lmns-m9与 t. afroharzianum的亲缘关系最近，98%的自展支持率聚为一个分支（图5）。

5、非洲哈茨木霉lmns-m9具有抑菌、防治真菌病害的作用，以及营养和空间竞争优势及重寄生、促生等方面作用。

6、首先，非洲哈茨木霉lmns-m9对5种藜麦真菌病害的病原（ b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a. alternata、 t. roseum）具有显著的抑制作用，抑制率为33.3% ~ 61.5%；其次，非洲哈茨木霉lmns-m9可抑制 a. caulina、 a. alternata、 t. roseum等病产生分生孢子，产孢量降低幅度为70.9% ~ 100%。第三，非洲哈茨木霉lmns-m9具有显著的营养和空间竞争优势，能覆盖 a. caulina、 f. citri、 a. alternate等病原的菌落，侵占病原的菌落的生存空间。第四，非洲哈茨木霉lmns-m9具有显著的重寄生作用，可接触、缠绕 b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a. alternata等病原的菌丝，致使 b. cinerea、 f. citri、 a. alternata等病原的菌丝断裂或消解。总之，通过上述的多重综合作用，非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦真菌病害防治效果显著，藜麦灰霉病、藜麦叶斑病、藜麦黑茎病、藜麦穗腐病等的防治效果为62.6%~ 72.2%

7、除防治藜麦真菌病害效果显著外，将非洲哈茨木霉lmns-m9制备成固体发酵基质后，还可促进藜麦提早2 d出苗，促生率达130.0%；加快藜麦幼苗的根的生长，提高了71.9%；增加藜麦的根鲜重、总鲜重和总干重，分别提高了104.7%、30.8%、28.6%。

8、所述的非洲哈茨木霉lmns-m9制备固体生物菌剂的方法，包括如下步骤：

9、（1）菌株活化

10、将非洲哈茨木霉lmns-m9接种至菌丝培养基，置于30 ℃、12 h光照/12 h黑暗的环境中培养3 d，待菌丝长满培养基后备用；

11、（2）制备产孢菌种

12、在步骤（1）菌丝培养基的菌落边缘打取直径5 mm菌饼的25 ~ 30个，把菌饼接种至产孢培养基并摇晃均匀，置于30 ℃、12 h光照/12 h黑暗的环境中培养7 d，待菌种产孢后备用；

13、（3）制备固体生物菌剂

14、将步骤（2）制备产孢菌种的产孢培养基按质量9% ~ 15%接种至固体发酵基质并混匀，最后将其置于30 ℃的环境中培养7 d，制备成固体生物菌剂。

15、所述的菌丝培养基的制备方法是：称取葡萄糖20.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、蛋白胨2.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20.0 g、玉米粉40.0 g，将以上物质充分混合均匀，加1 l蒸馏水搅拌使其充分溶解，用1 mol/l的hcl调节ph至5，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

16、所述的产孢培养基的制备方法是：称取浸泡6 h燕麦粒900 g、浸泡1 h藜麦粒100g、葡萄糖20.0 g、磷酸氢二钾1.0 g、硝酸铵2.0 g、硫酸镁0.5 g、玉米粉40.0 g，将以上物质充分混合均匀，用1 mol/l的hcl调节ph至5，分装于250 ml三角瓶中，装瓶量为100 ml，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

17、所述的固体发酵基质的制备方法是：将草炭和蛭石按1:1充分混合均匀；然后由以下质量份的成分组成，草炭和蛭石混合物100、葡萄糖2.0、磷酸氢二钾0.1、硝酸铵0.2、硫酸镁0.05、玉米粉4.0，混合均匀后将其水分含量调整至25% ~ 28%、ph调节至5，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

18、所述的非洲哈茨木霉lmns-m9固体生物菌剂的使用方法

19、（1）育苗使用方法

20、将非洲哈茨木霉lmns-m9固体生物菌剂分装到营养钵，藜麦播种后用地膜覆盖基质表面直至出苗。

21、（2）移栽使用方法

22、在距藜麦植株8 ~ 10 cm处，穴施固体生物菌剂，每亩约10 ~ 15公斤，施固体发酵基质后覆盖地膜，待7 ~ 10d，移栽藜麦幼苗。

23、（3）露地直播使用方法

24、按35~ 45 cm的行距开沟，沟深5 ~ 8 cm，沟施固体生物菌剂，每亩约15~ 20公斤，播种后覆盖地膜。

25、（4）生长期使用方法

26、在距藜麦植株10 ~ 15 cm处，穴施固体生物菌剂，每亩施用35~ 40公斤。

27、非洲哈茨木霉lmns-m9鉴定及防治藜麦真菌病害及促进藜麦生长试验

28、1、藜麦种子内生生防菌lmns-m9的鉴定

29、（1）试验方法

30、在山西省忻州市静乐县娑婆乡娑婆村藜麦种植区采集成熟的藜麦穗，从其种子中应用内生菌分离筛选方法获得藜麦种子内生真菌。藜麦种子依次用75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸钠浸泡5 min，75%乙醇浸泡1 min，无菌水漂洗3次，取最后1次漂洗液作为空白对照。将漂洗后的籽粒置于无菌环境中自然风干，然后接种至pda，25 ℃黑暗培养。待种子表面形成菌落后，用接种针挑取边缘菌丝于pda上、25 ℃培养、反复纯化3−5代，纯化的菌株4 ℃低温保存、备用。将菌株接种于pda25 ℃培养7 d，观察菌落形态；采用改良插片法在bx53显微镜下观察分生孢子、瓶梗等形态，并测量相关显微数据。

31、（2）试验结果

32、从藜麦种子中共分离到内生真菌9株，预实验中发现lmns-m9对藜麦病害病原有较好的抑菌作用。菌株lmns-m9的形态特征：在pda上，可观察到黄绿色的产孢簇（图1）；分生孢子梗呈金字塔形，主轴锐角或直角分支，末端多轮生3个 ~ 4个瓶梗，瓶梗烧瓶状，分生孢子球形至卵圆形（图2）；分生孢子梗平均大小9.3×2.9μm，分生孢子大小平均4.1×2.9 μm（图3）；相比已有的非洲哈茨木霉相关菌株，lmns-m9的分生孢子较大。

33、分子生物学特征：lmns-m9的tef1基因序列长度为1241 bp，genbank中编号oq509672。以tef1基因序列构建系统发育树，lmns-m9与 t. afroharzianum的亲缘关系最近，自展支持率为98%（图 4）。综合形态学和系统发育分析，确定lmns-m9为非洲哈茨木霉 trichoderma afroharzianum。

34、、抑菌藜麦真菌病害病原菌试验

35、（1）试验方法

36、抑菌作用测定：将非洲哈茨木霉lmns-m9 在25℃培养5 d，将非洲哈茨木霉lmns-m9接种至距离pda边缘5 mm处，在其中心对称点接种5种藜麦真菌病害病原的菌饼（交链格孢 a. alternata、灰葡萄孢 b. cinerea、柑橘镰孢 f. citri、粉红单端孢 t. roseum、茎生壳二孢 a. caulina），只接种病原菌为对照，25℃培养、重复3次。7 d时观察并测量菌落半径，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照的菌落半径-处理的菌落半径）/对照的菌落半径×100。

37、竞争作用测定：木霉拮抗系数进行分级，ⅰ级：木霉菌丝覆盖率100%；ⅱ级：木霉菌丝覆盖率>2/3；ⅲ级：1/3<木霉菌丝覆盖率<2/3；ⅳ级：木霉菌丝覆盖率<1/3；ⅴ级：病原菌菌丝覆盖率100%。

38、重寄生作用测定：采用涂片接种法对峙培养，lmns-m9和供试病原菌25℃培养3 d收集菌丝，用无菌水洗脱制成菌丝悬浮液。待灭菌的pda冷却至50℃左右，取1 ml均匀涂布于无菌载玻片，大小约4.0 cm×2.5 cm×0.1 cm。待其凝固后，分别取lmns-m9和供试病原菌的菌丝悬浮液20 l，接种至上述涂片两端（间隔2 cm），置于铺有灭菌湿滤纸的培养皿中，25 ℃培养1−2 d、重复3次，在显微镜下观察重寄生现象。

39、（2）试验结果

40、非洲哈茨木霉lmns-m9与5种病原菌对峙培养，在与5种病原菌的交界处产生抑菌带（图5~图9），说明菌株lmns-m9可抑制 b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a. alternata和 t. roseum的菌落丝生长。同时，菌株lmns-m9具有显著的竞争优势；对峙培养12 d时，菌株lmns-m9能覆盖 a. caulina（图6）、 f. citri（图7）、 a. alternate（图8）3种病原的菌落。非洲哈茨木霉lmns-m9对 b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a. alternata、 t. roseum的抑菌率依次为35.9%、61.5%、33.3%、41.9%和59.1%（详见表1）。

41、表1 非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦真菌病害病原的抑制效果

42、

43、由表1可知，非洲哈茨木霉lmns-m9产生可抑制5种藜麦真菌病害的病原菌丝生长。同时，可显著抑制 a. caulina、 a. alternata、 t. roseum等病原真菌产生分生孢子，进而控制病原菌的群体数量。菌株lmns-m9可显著降低 a. caulina、 a. alternata、 t. roseum等病原的分生孢子的产生、降低幅度为70.9% ~100%（表2）。

44、表2 非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦真菌病害病原产孢的抑制效果

45、

46、非洲哈茨木霉lmns-m9的菌丝可接触、缠绕 b. cinerea（图10）、 a. caulina（图11）、 f. citri（图12）、 a. alternata（图13）的菌丝（黑色箭头所指），能使 b. cinerea、 a.  caulina、 f. citri、 a. alternata的菌丝断裂、消解，说明菌株lmns-m9具有重寄生作用（图10~图13）。

47、、非洲哈茨木霉lmns-m9产孢优化试验

48、（1）试验方法

49、配置产孢培养基：称取浸泡6 h燕麦粒900 g、浸泡1 h藜麦粒100 g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0 g、硝酸铵2.0 g、硫酸镁0.5 g、玉米粉40.0 g混合。再使用1 mol/l的hcl调节ph至5，分装于250 ml三角瓶中、装瓶量为100 ml，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。将活化菌株lmns-m9接种至产孢培养基并摇晃均匀，最后将其置于30 ℃、12 h光照/12 h黑暗的环境中培养7 d；试验表明在产孢培养基上非洲哈茨木霉lmns-m9的产孢量约2.5×109cfu/ml、显著高于其它培养基（表3）。

50、表3 非洲哈茨木霉lmns-m9在不同培养基上的产孢量

51、

52、制备固体生物菌剂：将草炭和蛭石按1:1充分混合均匀；然后由以下质量份的成分组成，草炭和蛭石混合物100、葡萄糖2.0、磷酸氢二钾0.1、硝酸铵0.2、硫酸镁0.05、玉米粉4.0，混合均匀后将其水分含量调整至25% ~ 28%、ph调节至5，于121 ℃高压蒸汽灭菌20min。待其冷却后将产孢菌种按质量百分比10%接种至无菌固体发酵基质并混匀，置于30 ℃的环境中培养7 d后制备成固体生物菌剂。

53、（2）试验结果

54、试验表明在固体生物菌剂上可显著提高非洲哈茨木霉lmns-m9的产孢能力、产孢量约6.0×109cfu/ml、显著高于其它培养基（见表3）。

55、、非洲哈茨木霉lmns-m9促进藜麦种子发芽试验和促进藜麦幼苗生长试验

56、（1）试验方法

57、处理为将非洲哈茨木霉lmns-m9固体生物菌剂分装到营养钵（口径11 cm，底径8cm，盆高10 cm），每盆播种供试藜麦种子10粒；对照为未发酵的无菌基质，藜麦播种后用地膜覆盖基质表面直至出苗、重复5次。播种后2 ~ 4 d，每天统计出苗率。

58、（2）试验结果

59、试验结果表明，相比对照在含非洲哈茨木霉lmns-m9的固体生物菌剂上藜麦可提早2 d出苗、促生率达130.0%，在含非洲哈茨木霉lmns-m9的固体发酵基质上2 d时出苗率达69.0%（表4）。

60、表4 非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦种子的萌发和根系发育的促进作用

61、

62、处理组幼苗的根长显著高于对照组，可达9.32 cm，提高了71.9%（表4）；同时，处理组根鲜重、总鲜重、总干重分别为0.06 g、1.02 g、0.09 g，提高了104.7%、30.8%、28.6%，显著高于对照组（表4），说明在含非洲哈茨木霉lmns-m9的固体生物菌剂上提早藜麦种子的萌发、有效促进根系发育、增强根系活力。

63、、菌株lmns-m9的田间防治效果试验

64、（1）试验方法

65、采用露地直接播种法，按35 ~ 45 cm的行距开沟（约5 cm ~ 8 cm），沟施非洲哈茨木霉lmns-m9的固体生物菌剂、每亩约15~20公斤，播种后覆盖地膜、注意保湿。幼苗期在距藜麦植株8 ~ 10 cm处，穴施非洲哈茨木霉lmns-m9的固体生物菌剂、每亩施用35 ~ 40公斤，不施菌剂做空白组对照。在藜麦病害发生期，采用随机调查的方法统计藜麦灰霉病、藜麦叶斑病、藜麦黑茎病、藜麦穗腐病等的发病率。

66、（2）试验结果

67、试验结果表明本发明涉及的非洲哈茨木霉lmns-m9的固体生物菌剂对藜麦真菌病害的防治效果显著，相比对照组显著降低了藜麦灰霉病、藜麦叶斑病、藜麦黑茎病、藜麦穗腐病等病害的发病率，对这4种藜麦真菌病害防治效果显著、防效为62.6% ~ 72.2%（表5）。

68、表5 非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦真菌病害的防治效果

69、

70、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

71、（1）本发明的非洲哈茨木霉lmns-m9对5种藜麦真菌病害的病原（ b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a. alternata、 t. roseum）具有显著抑制作用，抑制率为33.3% ~61.5%。同时，菌株lmns-m9具有显著的营养和空间竞争优势，能覆盖 a. caulina、 f. citri、 a. alternate等病原的菌落，侵占病原的菌落的生存空间。此外，lmns-m9可抑制病原真菌产生分生孢子，将能降低其分生孢子控制病原菌的群体数量；将 a. caulina、 a. alternata、 t. roseum等病原的分生孢子含量大幅度降低、降低幅度为70.9% ~100%。本发明所涉及的菌株lmns-m9具有显著的重寄生作用，可接触、缠绕 b. cinerea、 a. caulina、 f. citri、 a.  alternata等病原的菌丝，致使 b. cinerea、 f. citri、 a. alternata等病原的菌丝断裂或消解。

72、（2）本发明的非洲哈茨木霉lmns-m9对藜麦出苗和促生田间应用效果好，相比对照在含非洲哈茨木霉lmns-m9的固体发酵基质上藜麦可提早2 d出苗、促生率达130.0%。在含非洲哈茨木霉lmns-m9的固体发酵基质上藜麦幼苗的根长显著高于对照组，提高了71.9%；同时，藜麦的根鲜重、总鲜重、总干重显著高于对照组，分别提高了104.7%、30.8%、28.6%。

73、（3）本发明优化了非洲哈茨木霉lmns-m9的产孢条件，显著提高了非洲哈茨木霉lmns-m9在固体生物菌剂上的产孢能力。实施例结果表明：产孢量从2.5×109cfu/ml提高至6.0×109cfu/ml。

74、（4）本发明的非洲哈茨木霉lmns-m9可降低藜麦真菌病害的发病率、防治效果显著。实施例结果表明：对藜麦灰霉病、藜麦叶斑病、藜麦黑茎病、藜麦穗腐病等病害的防治效果为62.6% ~ 72.2%。

75、附图和附表说明

76、图1 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9在pda上形成的产孢簇。

77、图2为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9的分生孢子梗和瓶梗。

78、图3 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9的分生孢子。

79、图4 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9的系统发育树。

80、图5 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9与 b. cinerea的对峙培养。

81、图6 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9与 a. caulina的对峙培养。

82、图7 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9与 f. citri的对峙培养。

83、图8为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9与 a. alternate的对峙培养。

84、图9为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9与 t. roseum的对峙培养。

85、图10为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9对 b. cinerea的重寄生作用。

86、图11为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9对 a. caulina的重寄生作用。

87、图12 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9对 f. citri的重寄生作用。

88、图13 为本发明非洲哈茨木霉lmns-m9对 a. alternata的重寄生作用。