因子Ⅷ缺乏血浆保护剂及其应用的制作方法

本发明涉及体外诊断试剂，具体涉及因子ⅷ缺乏血浆保护剂及其应用。

背景技术：

1、凝血因子ⅷ(fⅷ)是参与血液凝固过程的一种球蛋白，肝脏和血管内皮是fviii合成的主要部位。fⅷ存在于血浆中，它在血浆中含量约为0.1mg/l，是所有血浆凝血因子中含量最低者。fⅷ的功能是作为fⅸa的辅因子参与fⅸa对fⅹ的激活。但血浆中的fⅷ以异二聚体形式存在，无内在活性，要经过凝血酶或fⅹa酶解激活才能转为具有活性形式的辅因子fⅷa。在ca2+存在条件下，fⅷa与fⅸa在磷脂表面形成复合物(fⅷa-fⅸa)，能使fⅸa对fⅹ激活的速率大大提高。

2、血浆中fⅷ活性水平升高，主要见于高凝状态和血栓性疾病，尤其是静脉血栓形成性疾病，如深静脉血栓形成、肺栓塞、肾病综合征、口服避孕药、妊娠高血压综合征(简称妊高征)、恶性肿瘤、肝病等。血浆中fⅷ活性水平降低，常见于血友病(hemophilia)，血友病是最早被发现和最为常见的遗传性出血性疾病，这种疾病是由凝血因子ⅷ缺乏或缺陷引起的，因此凝血因子ⅷ活性检测对疾病诊治具有重要的临床意义。

3、凝血因子viii测定方法主要为凝固法和发色底物法。市面上采用凝固法测定凝血因子viii试剂盒分为两种。一种是二期检测法，该法是基于检测因子viii作为辅因子与因子ixa形成复合物活化因子x的能力，通过检测生成的因子xa的量可计算因子viii的活性。该实验分为两步进行，第一步：待测标本与含有磷脂、钙离子、因子ixa以及因子x的试剂溶液进行孵育后生成因子xa；第二步再加入过量的凝血酶原和纤维蛋白原，检测纤维蛋白凝块形成的时间。测得的凝固时间可以通过查对已知凝血因子活性的定标曲线或代入回归方程，得到凝血因子活性。另一种是一期检测法，该法是基于检测待测标本对乏因子血浆所致的凝固时间(activated partial thromboplastin time,aptt)延长的纠正能力，是目前最常用的凝血因子活性测定方法。将稀释后的待测血浆与因子ⅷ缺乏血浆混合后进行aptt检测，检测结果与待测血浆中的凝血因子ⅷ活性呈负相关。通过使用已知凝血因子ⅷ活性的血浆进行系列稀释并与因子ⅷ缺乏血浆混合后进行aptt检测建立的定标曲线，可以得出待测血浆中凝血因子ⅷ的活性，具有灵敏度高、操作简便的特点。

4、现在市场上已经有多家试剂盒用于因子viii活性的测定，但大多数都只适配自己厂家的凝血分析仪，适用性有限，且目前国内市场上的同类产品均为国外生产，价格昂贵，检测成本高，到货时间长，易受外界环境等因素的影响，导致凝血因子失活，从而导致试剂盒稳定性降低。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供因子viii缺乏血浆保护剂及其应用，本发明提供的因子viii缺乏血浆保护剂能够有效的保护因子viii缺乏血浆在冻干前后的活性，其制备方法简单、价格低廉、精密度高且稳定性强。

2、本发明提供了保护剂，包括缓冲剂、冻干保护剂和防腐剂，其中，

3、所述缓冲剂包括hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种；

4、所述冻干保护剂包括硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、组氨酸、甘氨酸、蔗糖和海藻糖中的至少一种；

5、所述防腐剂包括叠氮钠、环丙沙星、硫柳汞、庆大霉素和proclin-300中的至少一种。

6、相比较其他组分的选择，本发明提供的所述保护剂中各组分相互配合，共同为制备冻干血浆提供了更加稳定的冻干体系，能够最大程度的保护血浆中各凝血因子及纤维蛋白酶原的活性，有效地稳定血浆，从而获得更准确的技术效果。

7、在一些具体实施例中，所述冻干保护剂为硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、组氨酸和海藻糖。相比较其他组分，由于冻干保护剂中同时包含组氨酸与海藻糖，从而能够有效的降低冻干过程对血浆中活性因子的影响；由于包含硫酸镁和聚乙烯吡咯烷酮能够有效提高血浆稳定性。组氨酸、海藻糖、硫酸镁和聚乙烯吡咯烷酮四种组分共同用作冻干保护剂，四种组分之间配合紧密，同时兼顾血浆中各凝血因子及纤维蛋白酶原的活性及稳定性，从而获得更准确的技术效果。

8、优选的，所述缓冲剂为hepes缓冲液。

9、优选的，所述防腐剂为环丙沙星。

10、相比较其他组分，以上保护剂的各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合冻干血浆的制备，从而获得更准确的技术效果。

11、优选的，所述保护剂由水、10～80mm hepes缓冲液、1～10mm硫酸镁、0.1～1g/l聚乙烯吡咯烷酮、10～50g/l组氨酸、10～50g/l海藻糖和0.001％～0.005％(w/v)环丙沙星组成，所述保护剂的ph值为7.5。

12、采用上述组分及浓度范围的保护剂制备的冻干血浆与市售产品进行对比实验，对正常范围定值质控血浆与病理范围定值质控血浆进行精密度检测，结果表明本发明提供的血浆所测定的正常范围定值质控血浆与病理范围定值质控血浆的变异系数(cv)均小于市售产品，精密度更好，冻干前后血浆的检测活性相对偏差较小，冻融、复溶及长期稳定性高，从而获得更准确的技术效果。

13、进一步优选的，所述保护剂由水、50mm hepes缓冲液、5mm硫酸镁0.5g/l聚乙烯吡咯烷酮、25g/l组氨酸、25g/l海藻糖和0.002％(w/v)环丙沙星组成，所述保护剂的ph值为7.5。

14、实验表明，在此浓度下，所述保护剂配合制备的冻干血浆效果最佳，精密度最好，冻干前后血浆的检测活性相对偏差最小，冻融和复溶稳定性最高，从而获得更准确的技术效果。

15、本发明还提供了所述的保护剂在制备凝血因子缺乏血浆或包含凝血因子缺乏血浆的试剂盒中的应用。

16、优选的，所述凝血因子缺乏血浆包括因子ⅷ缺乏血浆。在一些具体实施例中，所述因子ⅷ缺乏血浆为人源因子ⅷ缺乏血浆。

17、本发明提供了因子ⅷ缺乏血浆或包含因子ⅷ缺乏血浆的试剂盒，包括人乏ⅷ因子血浆和所述的保护剂。

18、本发明提供了所述的因子ⅷ缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。

19、本发明提供了凝血因子活性检测试剂盒在检测人血浆中因子ⅷ活性的方法，具体步骤如下：

20、(1)用缓冲液按照1:10比例稀释血浆样本，用移液管吸到试管中，37℃下预温；

21、(2)因子viii缺乏血浆与稀释后的血浆样本以1:1的体积比混合，于37℃下混合并孵育2分钟；

22、(3)加入aptt试剂与稀释后的血浆样本以1:1的体积比混合，于37℃下混合并孵育2分钟；

23、(4)加入0.025mol/l cacl2试剂与稀释后的血浆样本以1:1的体积比混合，于37℃下反应2分钟，测定凝固时间；

24、(5)根据已知的标准曲线计算得到血浆样本中的因子viii活性。

25、本发明提供了包括缓冲液、冻干保护剂和防腐剂的保护剂，包括因子viii缺乏血浆和保护剂的因子viii缺乏血浆以及因子viii缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明提供的保护剂能够有效保障因子viii缺乏血浆中蛋白的稳定性及活性，因子viii缺乏血浆的精密度更高，进一步提高包含因子viii缺乏血浆的产品性能。本发明的保护剂中，采用组氨酸、海藻糖、硫酸镁和聚乙烯吡咯烷酮四种组分共同用作冻干保护剂，其中组氨酸与海藻糖能够有效的降低冻干过程对血浆中活性因子的影响，硫酸镁和聚乙烯吡咯烷酮能够有效提高血浆稳定性，包括冻融稳定性、复溶稳定性及长期稳定性，本发明提供的因子viii缺乏血浆保存39个月活性检测基本不变。本发明提供的因子viii缺乏血浆适用于市场上常见的大多数全自动凝血分析仪。