枯草芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法、测定β-胡萝卜素降解酶液的酶活的方法与流程

本发明属于食品领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌，还涉及制备益生菌制剂的方法、制得的益生菌制剂、测定β-胡萝卜素降解酶液的酶活的方法。

背景技术：

1、β-胡萝卜素属于类胡萝卜素，是一种橘黄色的脂溶性化合物，也是维生素a合成的前体物质，在食品和医药领域常用作着色剂、营养强化剂和抗氧化剂；β-胡萝卜素的纯品略带异臭，经降解后可产生异佛尔酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内脂、β-柠檬醛、β-紫罗兰酮、β-二氢大马酮、氧化异佛尔酮等香气成分，是香精香料工业的重要原料之一。

2、β-胡萝卜素在有水存在的体系中的溶解性较差，然而，采用β-胡萝卜素降解酶进行β-胡萝卜素酶促降解反应需要水的参与，故需提高β-胡萝卜素在有水存在的体系中的溶解性。常见的方法为：将β-胡萝卜素溶解于二氯甲烷和吐温-80中，在避光条件下将二氯甲烷挥发干净，再往β-胡萝卜素和吐温-80的复合物中加水使其分散于水溶液中。但是，上述方法存在两个缺陷：其一是二氯甲烷易挥发，具有强烈的刺激性气味、较强的生物毒性和环境污染性，需采用专门设备加速挥发，实验条件要求较高；其二是吐温-80对β-胡萝卜素降解酶的影响程度未知，未必能真正满足β-胡萝卜素酶促降解反应的要求。

3、因此，目前亟需解决β-胡萝卜素在有水存在的体系中溶解性较差的问题，并且克服上述的缺陷。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种枯草芽孢杆菌4-1，其对于β-胡萝卜素的吸附率高达60％以上；基于此，本发明又一目的在于提供一种制备益生菌制剂的方法，所制益生菌制剂中的枯草芽孢杆菌4-1能够富集β-胡萝卜素，从而得到一种富集β-胡萝卜素的益生菌制剂；本发明的又一目的在于提供一种测定β-胡萝卜素降解酶液的酶活的方法，从而准确测定含有水的β-胡萝卜素降解酶液的酶活。

2、为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌4-1，其保藏编号为cgmcc no.24241，保藏日期为2022年1月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。

3、本发明的发明人从福建三明尤溪elc1cb-2019中等片烟分离得到了一种枯草芽孢杆菌4-1，其具有吸附富集β-胡萝卜素的特性，对于β-胡萝卜素的吸附率可高达60％以上，为制备富集β-胡萝卜素的益生菌制剂奠定了技术基础。

4、本发明第二方面提供了一种制备益生菌制剂的方法，包括如下步骤：

5、将β-胡萝卜素溶解于二甲基亚砜，得到溶液；优选振荡处理0.5-5分钟(例如1分钟)进行溶解；更优选在振荡处理后静置5-20分钟，例如10分钟；

6、将本发明第一方面的枯草芽孢杆菌4-1配制成菌悬液；

7、将所述溶液、所述菌悬液、培养基、可选的二甲基亚砜及可选的水混合，在27℃-47℃(例如30℃、32℃、35℃、37℃、38℃、40℃、42℃、45℃)下培养12-36小时(例如15、18、20、24、28、30、32、35小时)，得到培养产物；优选在无菌环境中混合、培养；

8、可选地，将培养产物固液分离，收集固相物；

9、所述益生菌制剂为所述培养产物或固相物。

10、本发明第二方面的任意实施方式中，培养前，混合体系中的二甲基亚砜的体积含量小于4％，优选为小于或等于3％，更优选为1％-3％，例如1％、2％、3％。

11、本发明第二方面的任意实施方式中，培养前，混合体系中的枯草芽孢杆菌4-1与β-胡萝卜素的比例大于106cfu/mg，优选为大于或等于2×106cfu/mg，更优选为2×106cfu/mg至5×106cfu/mg，例如2.5×106cfu/mg、3×106cfu/mg、4×106cfu/mg。

12、本发明第二方面的任意实施方式中，培养前，混合体系中的二甲基亚砜与β-胡萝卜素的比例为0.1-2ml/mg，优选为0.25-1.75ml/mg，例如0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75ml/mg。

13、本发明第二方面的任意实施方式中，以重量份计，所述培养基包含：

14、

15、可选地，所述培养基还包含水。

16、本发明第二方面的任意实施方式中，所述培养基包含：

17、

18、本发明第二方面的任意实施方式中，所述方法包括如下的一项或多项：

19、(a)在振荡条件下培养；

20、优选地，振荡转速为80-400r/min，更优选为100-300r/min，例如200r/min；

21、(b)所述溶液中二甲基亚砜与β-胡萝卜素的比例为0.1-2ml/mg，优选为0.25-1.75ml/mg，例如0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75ml/mg；

22、(c)所述菌悬液的浓度为106cfu/ml至107cfu/ml，优选为106cfu/ml至8×106cfu/ml，例如2×106cfu/ml、4×106cfu/ml、5×106cfu/ml、6×106cfu/ml、7×106cfu/ml；

23、(d)通过离心处理进行固液分离；优选地，以11000-13000r/min(更优选为11500-12500r/min，例如12000r/min)的转速离心处理5-15分钟(例如8、10、12分钟)；

24、(e)所述培养基和菌悬液的体积比为40:1-54:1，优选为44:1-50：1，例如42:1、45:1、46:1、47:1、48.5:1、49:1、52:1；

25、(f)所述培养基和溶液的体积比为70:1-110:1，优选为80:1-100:1，例如75:1、78:1、85:1、87:1、90:1、92:1、95:1、97:1、105:1；

26、(g)采用无菌水配制菌悬液；

27、(h)混合前，将所述培养基灭菌处理；优选地，培养基在110℃-130℃(例如121℃)下灭菌处理10-30分钟(例如20分钟)；优选地，灭菌处理前，将培养基采用0.22μm透气滤膜封口。

28、本发明第三方面提供了一种益生菌制剂，由本发明第二方面的方法制得。

29、本发明第四方面提供了一种测定β-胡萝卜素降解酶液的酶活的方法，包括如下步骤：

30、(1)将β-胡萝卜素溶解于二甲基亚砜中，得到第一溶液；

31、(2)将所述第一溶液与水在冰浴条件下混合，得到第二溶液；

32、(3)将所述第二溶液、β-胡萝卜素降解酶液、可选的二甲基亚砜及可选的水混合，在30℃-50℃(例如32℃、35℃、37℃、39℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃)水浴条件下反应小于30分钟(优选为小于或等于20分钟，更优选为1-20分钟，例如3、5、7、10、13、15、17、20、25、28分钟)；

33、(4)采用酶标仪分别测定混合体系在反应前与反应后的460nm波长吸光度，根据两个吸光度计算反应过程中β-胡萝卜素降解量，按照如下公式计算β-胡萝卜素降解酶液的酶活；

34、

35、其中，β-胡萝卜素降解量的单位为mg，反应时间的单位为分钟，β-胡萝卜素降解酶液体积的单位为ml，β-胡萝卜素降解酶液的酶活的单位为u/ml。

36、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(4)中，根据两个吸光度通过外标分析法分别计算出混合体系在反应前与反应后的β-胡萝卜素含量，然后得到反应过程中β-胡萝卜素降解量。

37、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(4)中，将混合体系在反应前与反应后的吸光度分别代入标准曲线，计算出混合体系在反应前与反应后的β-胡萝卜素含量，做差得到反应过程中β-胡萝卜素降解量。

38、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(4)中，标准曲线表示β-胡萝卜素质量与460nm波长吸光度的线性关系。

39、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(4)中，测定β-胡萝卜素质量不同的标准溶液在460nm波长的吸光度，根据β-胡萝卜素质量与吸光度建立标准曲线。

40、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(3)中，反应前，混合体系中的二甲基亚砜体积含量为5％-45％，优选为5％-40％，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％。

41、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(3)中，反应前，混合体系中的水的体积含量为30％-75％，优选为40％-65％，例如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％。

42、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(3)中，反应前的混合体系中，β-胡萝卜素的质量与β-胡萝卜素降解酶液中的干物质体积的比例为20-800mg/ml，例如50、80、100、200、300、350、400、450、500、600、700mg/ml。

43、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(1)中，二甲基亚砜与β-胡萝卜素的比例为0.5-5ml/mg，优选为1-3.5ml/mg，例如1、1.5、2、2.5、3、3.5ml/mg。

44、本发明第四方面的任意实施方式中，步骤(2)中，混合体系中的水与二甲基亚砜的体积比为2:1-105:1，优选为4:1-99:1，例如3:1、4:1、8:1、10:1、11.5:1、15:1、20:1、24:1、30:1、35:1、40:1、45:1、49:1、60:1、70:1、80:1、90:1、99:1、100:1、103:1。

45、本发明中，酶液的酶活是指每毫升的酶液在40℃下酶解20分钟所降解的β-胡萝卜素毫克数，单位为u/ml。

46、本发明取得了如下的有益效果：

47、1、本发明的枯草芽孢杆菌4-1具有富集β-胡萝卜素的特性，对于β-胡萝卜素的吸附率可高达60％以上。

48、2、本发明的益生菌制剂中含有能富集β-胡萝卜素的枯草芽孢杆菌4-1，发挥益生菌功效的同时可足量补充β-胡萝卜素。

49、3、本发明方法能在有水存在的体系中准确测定β-胡萝卜素降解酶液的酶活。