一种食淀粉乳杆菌及其在改善胆汁淤积性肝病中的应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一种食淀粉乳杆菌(lactobacillusamylovorus)及其在改善胆汁淤积性肝病中的应用。

背景技术：

1、胆汁淤积性肝病是由各种原因引起的胆汁生成、分泌和排泄障碍，不能主动经胆小管排至肠腔，在肝内淤积，反流入血，而引起的一系列器质性损害、代谢失调和功能紊乱的肝胆系统疾病。胆汁淤积性肝病的发生原因较复杂，病因主要包括遗传、免疫、变性、感染、结石及肿瘤等。如不及时有效治疗，甚至可能进展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝肿瘤。流行病学证据显示，我国胆汁淤积性肝炎的发生率占慢性肝病患者的10％以上。目前临床上主要的治疗药物有熊去氧胆酸(udca)、s-腺苷蛋氨酸、考来烯酸胺、奥贝胆酸和贝特类药等，其中udca是临床推荐一线药物，主要目的是改善由于胆汁淤积所致的临床症状和肝脏损伤。然而，临床疗效尚无法令人满意，约有30％的患者对udca无效，且udca起效缓慢，较为昂贵，因此临床上急需更有效的药物。

2、细菌可以主动地将纳米大小的膜囊泡释放到细胞外环境中，这种20-400nm的球形结构被称为胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)。evs可携带多种生物遗传信息，例如核酸、酶、效应蛋白和毒力因子等，其结构使evs在细菌竞争、存活、物质交换、宿主免疫逃逸、调节、感染和入侵中扮演重要角色。基于益生菌的诸多促健康作用，益生菌来源的胞外囊泡evs所展现出来的有益作用如抗炎、抗肿瘤、在数项研究中已得到明确证实。最近，使用evs作为治疗剂已经成为一个有前景的研究领域。此外，纳米物质在体内的清除和处理与小分子物质有很大的不同。特别是，全身给药的小分子通常会经过快速的肾脏清除，而纳米颗粒则优先在肝脏中积累。生物纳米颗粒显示出与合成纳米颗粒类似的优势，包括多功能性和减少肾脏清除。此外，由于通过进化选择的优化，生物衍生的材料通常表现出更高的生物相容性和生理活性。因此，与人造颗粒相比，生物纳米颗粒作为治疗剂可能具有更优越的性能。此外，生物纳米粒子可以被进一步修改，以增强某些特性，如含量或膜特性。

3、随着在奶牛养殖场垃圾和玉米发酵液中发现了食淀粉乳酸菌(lactobacillusamylovorus，la)，世界各地的学者们就没有放弃过对它的研究与利用。国内外在工业、食品业、农业和医学等领域对提高食品中淀粉的利用效率和延长食品货架期等方面进行了大量的研究。它的生物降解和合成功能，以及抗菌和抗病毒的能力，都来自于食淀粉乳杆菌所分泌的一种酶或一种活性成分。食淀粉乳杆菌发酵的食品可以降低机体胆固醇，增强消化酶的活性，刺激有益微生物水解糖类物质，预防和治疗腹泻。但目前对食淀粉乳酸菌及其发酵液和胞外囊泡(evs)的研究十分有限，更鲜见其在治疗肝病方面的报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明从自然界中分离得到一株食淀粉乳杆菌，并制备了食淀粉乳杆菌发酵液或通过适当的提取方法制备了食淀粉乳杆菌胞外囊泡，其可应用于肝病的治疗与防护，且生产工艺简单高效，对环境无污染。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面是提供一种食淀粉乳杆菌，其名称为qc1h，分类命名为lactobacillus amylovorus，其保藏编号为cctcc no：m2023427，保藏日期为2023年3月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

4、进一步地，所述食淀粉乳杆菌从猪粪中筛选分离获得，其16srna序列与ncbi上现有食淀粉乳杆菌(lactobacillus amylovorus)的碱基序列同源性达到100％。

5、本发明的第二个方面是提供一种由任一上述的食淀粉乳杆菌制备的微生物菌剂，其含有所述食淀粉乳杆菌或由所述食淀粉乳杆菌发酵制备。

6、进一步地，所述微生物菌剂包含从所述食淀粉乳杆菌的发酵菌液上清液中提取的食淀粉乳杆菌胞外囊泡(laevs)。

7、进一步地，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的粒径在131～369nm。

8、进一步地，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡呈现典型的含有磷脂双分子层的泡状结构，为球形粒子，其中粒径为131nm的囊泡最多，约占56.7％。

9、进一步地，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的蛋白浓度为3.94μg/μl。

10、进一步地，所述食淀粉乳杆菌的发酵液的制备步骤包括：接种所述食淀粉乳杆菌进行培养，获得发酵菌液。

11、进一步地，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法包括步骤：

12、1)接种所述食淀粉乳杆菌进行培养，获得发酵菌液；

13、2)将步骤1)获得的发酵菌液进行离心操作，收集上清液；

14、3)将步骤2)获得的上清液过滤、超滤、离心，收集沉淀；

15、4)将步骤3)获得的沉淀重悬、过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。

16、具体地，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法包括步骤：

17、a)将冻存的食淀粉乳杆菌菌株活化，以2wt％接种量接种于mrs肉汤，37℃培养18h，获得发酵菌液；

18、b)将发酵菌液以5000g，4℃转速离心15分钟，去除沉淀，收集上清液；

19、c)将上清液用0.22μm过滤器过滤，过滤后使用超滤管5000g，4℃离心30分钟，得到的超滤液以120000g，4℃超速离心2小时，收集沉淀；

20、d)将沉淀用pbs重悬，使用0.22μm过滤器过滤，即得食淀粉乳杆菌胞外囊泡。

21、本发明的第三个方面是提供一种任一上述的食淀粉乳杆菌或任一上述的微生物菌剂在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂中的应用。

22、进一步地，所述制剂以食淀粉乳杆菌发酵液或食淀粉乳杆菌胞外囊泡为主要活性成分。

23、进一步地，所述制剂还包括药学上可接受的辅助成分。

24、进一步地，所述制剂中食淀粉乳杆菌胞外囊泡的有效使用剂量为1.2μg/kg。

25、进一步地，所述胆汁淤积性肝病为由ddc诱导的胆汁淤积性肝病。

26、进一步地，所述预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂包括改善胆汁淤积性肝病造成的肝功能损伤、炎性病变和/或肝纤维化的制剂。

27、进一步地，所述改善胆汁淤积性肝病造成的肝损伤炎性病变和/或肝纤维化包括以下功能中的至少一种：减少肝脏炎性细胞浸润和点灶状坏死面积、降低血清中肝酶水平、降低肝脏胆汁酸水平、降低肝脏炎性细胞因子的表达、降低肝纤维化标志物和/或相关基因的表达。上述降低血清中肝酶水平包括降低血清中alt、ast、alp等肝酶水平，降低肝脏炎性细胞因子的表达包括降低肝脏炎性细胞因子il-6、il-1β、tnf-α的mrna表达，降低降低肝纤维化标志物和/或相关基因的表达包括肝纤维化α-sma、vimentin的mrna表达。

28、与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

29、根据合成纳米粒子的研究，已经证明静脉注射的evs主要在肝脏中积累，使其特别适合治疗肝脏疾病，且研究表明肝脏损伤会进一步增加evs在该器官中的吸收，从而提升有机物输送率。本发明分离了一株食淀粉乳杆菌qc1h，由其制备的发酵液或由发酵液提取的胞外囊泡对胆汁淤积性肝损伤与炎性病变、肝纤维化具有良好的治疗效果，胞外囊泡的总蛋白含量为3.94μg/μl。上述胞外囊泡的生产工艺简单高效，对环境无污染，且具有高浓度、高效、性价比高、安全、低成本等有点，在肝病的治疗与防护方面具有较好的应用前景。