密码子优化的编码B-结构域缺失的凝血因子VIII蛋白的核酸及其用途的制作方法

发明领域本技术涉及遗传学、基因疗法和分子生物学的领域。更具体地，本发明涉及密码子优化的编码fviii-bdd(b-结构域缺失的凝血因子viii)蛋白的核酸，涉及基于此的表达盒和载体，涉及用于生产fviii-bdd的宿主细胞，以及涉及上述载体的各种用途。

背景技术：

0、发明背景

1、血友病是一种隐性的、x-连锁的遗传障碍，其造成参与继发性止血的蛋白之一的缺乏。血友病a(或经典血友病)是最常见的血友病变体；每5000名新生男性中就有1人患此病(2019年全球年度调查报告，wfh https://www.wfh.org/en/our-work-research-data/annual-global-survey)，并且它由凝血因子viii蛋白的缺乏造成。根据俄罗斯血友病协会(russian haemophilia society)，在俄罗斯有超过6500名血友病a患者(2019年全球年度调查报告，wfh)。

2、凝血因子viii(fviii)是一种主要从窦状隙肝上皮细胞分泌到血液中的280kda蛋白(fahs sa,hille mt,shi q,weilerh,montgomery rr.a conditional knockout mousemodel reveals endothelial cells as the principal and possibly exclusivesource ofplasma factor viii/blood.2014年6月12日；123(24):3706-13.doi:10.1182/blood-2014-02-555151.2014年4月4日电子公开.pmid:24705491和everett la,cleurenac,khoriaty rn,ginsburg d.murine coagulation factorviii is synthesized inendothelial cells/blood.2014年6月12日；123(24):3697-705.doi:10.1182/blood-2014-02-554501.2014年4月9日电子公开.pmid:24719406)。活化的fviii作为异源二聚体在生物体中循环，所述异源二聚体由通过非共价金属依赖性相互作用彼此结合的重链(a1、a2、b结构域)和轻链(a3、c1、c3结构域)组成。作为fviii加工的结果，只有a1-a3、c1、c2结构域存在于该蛋白的活化形式中。这一事实促进了b-结构域缺失的重组fviii(fviii-bdd)的产生，其活性不劣于全长fviii(pittman dd,alderman em,tomkinson kn,wang jh,gilesar,kaufman rj.biochemical,immunological,and in vivo functionalcharacterization of b-domain-deleted factor viii/blood.1993年6月1日；81(11):2925-35.pmid:8499631)。不同于主要属于蛋白酶的凝血级联的其它蛋白，fviii是一种糖蛋白。但是，它在活化的凝血因子x(fxa)的产生所必需的tenase复合物的形成中起重要作用，fxa是最后的共同凝血途径的第一个成员，该途径最终导致交联纤维蛋白形成。

3、fviii基因的内含子1或内含子22的倒位造成超过一半病例的重度血友病a(habartd,kalabova d,novotny m,vorlovaz.thirty-four novel mutations detectedin factorviii geneby multiplex csge:modeling of 13 novel amino acidsubstitutions/j thromb haemost.2003年4月；1(4):773-81.doi:10.1046/j.1538-7836.2003.00149.x.pmid:1287141)。在其它情况下，fviii序列中的异常与各种突变有关，所述突变包括反义突变、读框移位、剪接位点突变、缺失和插入。

4、在血友病a中的出血倾向与定义的fviii活性相关，并且被分类为轻度(0.05-0.40iu/ml)、中度(0.01-0.05iu/ml)或重度(<0.01iu/ml)。轻度血友病患者通常经历仅与医学干预或损伤有关的异常出血。相反，中度血友病患者对相对较轻的损伤表现出延长的出血反应，而重度疾病患者经常具有自发性出血。重度血友病a表现出自发性关节积血、软组织血肿、腹膜后出血、脑内出血和延迟术后出血。随着时间的推移，由复发性关节积血和软组织血肿引起的并发症可以导致严重的关节病、关节挛缩和假肿瘤，从而导致慢性疾病。具有血友病a的轻度、中度和重度变体的患者的比例尚不明确，但最近的流行病学研究报告称，约60％的血友病a患者具有重度变体(2019年全球年度调查报告，wfh)。

5、迄今为止，重组fviii注射剂形式的终身替代疗法是血友病a患者的护理标准(2019年全球年度调查报告，wfh)。尽管在治疗血友病方面取得了成功，但这种方案仍具有严重问题。血友病a的预防性替代疗法包括在患有该疾病的重度变体的患者的一生中每3天一次静脉内注射重组fviii。这种治疗方案是非常昂贵的，并且不能保证没有主要与关节积血相关的并发症。在某些情况下，患者产生抑制性抗体。血友病a的抑制性变体更常见于重度疾病的患者中，并且需要使用替代方案来治疗和预防该疾病(eckhardt cl,van der bomjg,van der naald m,peters m,kamphuisen pw,fijnvandraat k.surgery andinhibitor development in haemophilia a:a systematic review/j thrombhaemost.2011年10月；9(10):1948-58.doi:10.1111/j.1538-7836.2011.04467.x.pmid:21838755)。

6、借助于编码fviii基因的基于腺伴随病毒(aav)的病毒(表达)载体的血友病a的基因疗法已经在一系列临床前和临床研究中显示出优秀结果(bunting s,zhang l,xie l,bullens s,mahimkar r,fong s,sandza k,harmon d,yates b,handyside b,sihn cr,galicia n,tsuruda l,o'neill ca,bagri a,colosi p,long s,vehar g,carter b.genetherapy with bmn 270 results in therapeutic levels of fviii in mice andprimates and normalization of bleeding in hemophilic mice/mol ther.2018年2月7日；26(2):496-509.doi:10.1016/j.ymthe.2017.12.009.2017年12月14日电子公开.pmid:29292164和peyvandi f,garagiola i.clinical advances in gene therapy updates onclinical trials of gene therapy in haemophilia/haemophilia.2019年9月；25(5):738-746.doi:10.1111/hae.13816.2019年7月8日电子公开.pmid:31282050)。与治疗血友病的传统方案不同，使用aav的基因疗法允许在给患者单次施用治疗剂后数年内将外源性fviii的表达水平维持在足够的水平(long br,veron p,kuranda k,hardet r,mitchelln,hayes gm,wong wy,lau k,li m,hock mb,zoog sj,vettermann c,mingozzi f,schweighardt b.early phase clinical immunogenicity of valoctocogeneroxaparvovec,an aav5-mediated gene therapy for haemophilia a/mol ther.2021年2月3日；29(2):597-610.doi:10.1016/j.ymthe.2020.12.008.2020年12月10日电子公开.pmid:33309883)。

7、迄今为止，在世界上还没有注册用于治疗血友病a的基因治疗产品。

8、因此，需要开发用于治疗血友病a的基因治疗产品，以及将提高用于治疗血友病a的基因治疗产品的效力的解决方案。

技术实现思路

1、在有效基因疗法开发领域中的研究的紧迫目的之一是对载体中的目标基因进行密码子优化，以实现目标蛋白的最大生产水平，这反过来又将允许使用较低剂量的载体来实现显著效果。

2、本发明的作者出人意料地发现，密码子优化的核酸出人意料地造成增加的fviii-bdd基因表达水平、增加的凝血因子viii-bdd蛋白生产水平、以及增加的凝血因子viii-bdd蛋白活性水平，与编码凝血因子viii-bdd的野生型基因(fviii-bdd-wt)相比具有倍数增加，所述核酸编码具有seq id no:11的氨基酸序列的fviii-bdd(b-结构域缺失的凝血因子viii)蛋白并且包括选自seq id no:2(变体fviii-bddco-v1)、seq id no:3(变体fviii-bddco-v2)、seq id no:4(变体fviii-bddco-v3)或seq id no:5(变体fviii-bddco-v4)的核苷酸序列。具有选自seq id no:2(变体fviii-bddco-v1)、seq id no:3(变体fviii-bddco-v2)、seq id no:4(变体fviii-bddco-v3)或seq id no:5(变体fviii-bddco-v4)的核苷酸序列的根据本发明的密码子优化的核酸的这些变体被包括在表达盒和基于此的载体中。

3、定义和一般方法

4、除非在本文中另外定义，否则结合本发明使用的所有技术和科学术语将具有本领域技术人员通常理解的相同含义。

5、此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数术语，并且复数术语应包括单数术语。通常，本文描述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白和核酸的杂交和化学的当前分类和方法是本领域技术人员众所周知的并且在本领域中被广泛使用。如本领域常见的，或如本文描述的，根据生产商的指南进行酶反应和纯化方法。

6、术语“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可在自然界中发现的与人工生产的物体不同的物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列是天然存在的，所述序列可以从自然界中的来源分离出来并且没有在实验室中被人故意修饰。

7、如在本说明书和随后的权利要求书中所使用的，除非上下文另有规定，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体，诸如“包括”(includes)、“包括”(including)、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述的整数或整数集合，但是不排除任何其它整数或整数集合。

8、蛋白(肽)

9、如在本说明书中使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且它们表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

10、核酸分子

11、在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”是指精确的核苷酸序列(无论是否修饰)，其决定核酸的片段或区域(无论是否含有非天然核苷酸)，并且是双链dna或rna、单链dna或rna、或所述dna的转录产物。

12、如在本说明书中使用的，作为非限制性例子，多核苷酸包括通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，作为非限制性例子，所述方式包括重组方式，即使用普通克隆技术和pcr等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成方式。

13、这里还应包括，本发明不涉及在其天然染色体环境中(即在天然状态下)的核苷酸序列。本发明的序列已经被分离和/或纯化，即它们被直接或间接采样，例如通过复制，它们的环境已经被至少部分地改变。因此，本文还应提及通过重组遗传学(例如借助于宿主细胞)或通过化学合成而获得的分离的核酸。

14、除非另外指出，否则术语核苷酸序列涵盖其互补物。因此，具有特定序列的核酸应被理解为涵盖具有其互补序列的其互补链的核酸。

15、载体

16、本文中使用的术语“载体”是指能够运输已经与其连接的另一种核酸的核酸分子。此外，术语“载体”在本文中表示能够运输核酸的重组病毒颗粒。

17、在本说明书中使用的术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

18、用途

19、“基因疗法”是将基因插入受试者的细胞和/或组织中，以治疗疾病，通常是遗传性疾病，其中有缺陷的突变体等位基因被功能性等位基因替换。

20、“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“疗法(therapy)”表示减轻或消除生物障碍和/或至少一种其附随症状的方法。

21、术语”受试者”、“患者”、“个体”等在本说明书中可互换使用，并且它们表示适用于在本说明书中描述的方法的任何动物。在某些非限制性的实施方案中，所述受试者、患者或个体是人。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。

22、“治疗有效量”或“有效量”表示正在施用的治疗剂的量，该量将在某种程度上缓解正在治疗的疾病的一种或多种症状。