一种防治宫颈HPV感染的18价HPV复合卵黄中和抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种防治宫颈hpv感染的18价hpv复合卵黄中和抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、宫颈癌是人类恶性肿瘤中明确了致病病毒的疾病。研究证实，超过99％的宫颈癌组织中合并有人乳头瘤病毒(hpv)感染。hpv可特异性地在人体皮肤、黏膜上皮等增殖，从而导致上皮的良性和恶性肿瘤。

2、目前在全球范围，宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。宫颈癌发病，近年来呈年轻化趋势，严重危害女性健康。其发生和发展是由量变到质变，渐变到突变连续的演变过程，一般认为此过程历时10多年；宫颈上皮细胞内病变cin及宫颈hpv亚临床感染被认为是癌前病变与宫颈癌密切相关。调查显示，80％多的女性一生中会感染高危型hpv，其中一部分会自愈，称为“一过性感染”，而还有约20-30％的感染患者很难自我清除，称为“持续性感染”，这部分高危hpv持续性感染患者即为宫颈癌发生的高风险人群。宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，全球每2分钟有一人死于宫颈癌。全球被感染女性达30亿。迄今为止，医药界还没有开发出用于治疗人乳头瘤病毒(hpv)感染的有效药物，抗生素和其它杀菌药、消毒药对人乳头瘤病毒(hpv)完全没有作用。目前上市的hpv疫苗只有预防作用，而没有治疗hpv感染的作用。由于人乳头瘤病毒(hpv)是一种特殊的“无包膜病毒”，一侵入人体细胞就会脱去包膜外衣(衣壳蛋白l1/l2)；受感染细胞表面没有了疫苗所针对的衣壳蛋白l1靶抗原，造成疫苗失效；因此，hpv疫苗对hpv已侵入细胞、被检查出hpv感染阳性的患者既没有预防作用，更没有治疗作用。

3、对于人乳头瘤病毒(hpv)已进入细胞的阳性患者，除了注射疫苗无效外，传统抗体和许多中草药由于属于大分子，无法进入受感染细胞起作用；小分子化学药和部分小分子中药则由于没有特异性必然会对正常细胞产生强烈毒副作用。因此，目前既无药可治，也没有任何根除方法。最令人惊悚的是，其中受高危型人乳头瘤病毒(hpv)感染者，如不提前进行干预，五年后有20％可能发展成为癌症。

4、目前hpv的防治手段主要有hpv疫苗、中药、抗生素、干扰素等。

5、hpv疫苗：目前的hpv疫苗主要用于预防hpv感染，且适于没有感染过hpv的人接种，对于已感染hpv的人则不起作用。目前的hpv疫苗有二价、四价和九价，最多只能预防9个基因型的hpv感染，而导致宫颈癌的hpv有18个基因型，因此接种这些疫苗只能预防部分宫颈癌，会漏掉部分宫颈癌。

6、中药：中药成分的药物大部分是清热解毒作用，一般用做慢性妇科炎症的辅助治疗，不能作为对于hpv病毒的首选治疗。否则用“慢兵对强敌”让引起妇科炎症的病原体趁机扩散、发展，从而耽误了病情。

7、抗生素：健康女性的阴道为酸性环境，有自洁功能有益菌，长时间滥用抗生素和治疗妇科炎症的方法不当，会杀死阴道有益菌，破坏阴道的酸碱平衡，反而培养大量的抗药菌，往往使单一的炎症患者并发多重感染，反复感染妇科炎症往往会引起高危hpv感染，如果不采取有效措施，5年后癌变率1/5。

8、干扰素：干扰素作为常用治疗hpv病毒的抗病毒与抗肿瘤制剂，目前已较广泛地应用于临床。但干扰素产生作用特别慢，所以使用周期通常都在2到6个月。治疗后有效率只有50％左右。干扰素毒副作用普遍存在，最常见的是发热及流感样综合征，患者体重减轻、脱发、情绪激动，骨髓抑制致血细胞、血小板减少，轻度贫血，偶可发生神经系统损伤，影响内分泌系统功能，亦有产生干扰素抗体者。

9、因此，关于宫颈癌的预防存在如下几个问题：

10、1、hpv感染阳性患者注射疫苗无效，原因如下：(1)hpv进入宫颈柱状上皮细胞(感染)脱去外衣(衣壳蛋白)重新转录成e6、e7蛋白；(2)受感染细胞表面失去hpv疫苗的靶抗原—衣壳蛋白l1，所以疫苗无效；

11、2、抗hpv疫苗非广谱，hpv有100多种亚型，持续感染导致宫颈癌高危hpv有18个亚型，目前九价疫苗只能针对九种型别病毒。注射九价疫苗也不能实现完全保护。

12、3、为了防止宫颈癌，研制有预防和辅助治疗宫颈癌的组合物是非常必要的，但是现有的组合物存在潜在缺陷，含有较多的抗生素类药物，存在副作用，会破坏阴道正常菌群的生存环境。

13、因此，研究开发一种可使人乳头瘤病毒阳性患者“阳转阴”，以及可预防和治疗宫颈癌的新药，是关系到全球亿万女性健康和生命的大事，也是摆在国际医学科学界面前的一项重要课题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种防治宫颈hpv感染的18价hpv复合卵黄中和抗体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该18价hpv复合卵黄中和抗体可以有效防治hpv感染，进而可应用于宫颈癌的辅助治疗。

2、在宫颈上皮内高度病变和宫颈癌组织中，高危型有hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73；低危hpv基因型：6型和11型。

3、由于hpv难以通过体外组织培养或感染动物而进行繁殖，因此研究hpv药物的策略主要集中在基因工程技术方法上。抗原表位分为线性表位和立体表位。只有立体表位才能诱导出中和抗体。分子生物学研究发现hpv病毒结构蛋白的l1和l2构成病毒的衣壳部分，单纯的l1就足以形成病毒样颗粒(virus-like particles，vlp)，并具有良好的免疫中和作用，诱导出来的是中和抗体，且抗原免疫原性强，抗体效价高。

4、hpv主要的中和表位及型特异性表位都集中在蛋白l1上，且l1的中和表位大多为构象表位，l1在蛋白表达、纯化过程中正确构象的丧失往往会带来中和表位的丢失，可见无论是l1还是l1/l2组装产生的具有与天然病毒相同结构的类病毒颗粒(vlp)有着与天然病毒相同的大部分中和表位，可以诱导产生大量高滴度的中和保护抗体，是一种理想的疫苗形式。在hpv感染过程中，病毒表面的l1蛋白介导细胞受体识别和膜融合，能够特异性的识别并结合到人细胞表面受体，侵入人体细胞，造成人的感染。如能够研制出hpv的中和抗体，就能够中和hpv病毒，使病毒不能结合到细胞表面受体，阻断病毒的感染，从而达到预防和治疗hpv病毒感染引起的疾病作用。本发明采用生物工程技术，用昆虫细胞表达hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1的vlp抗原，将这些抗原免疫蛋鸡，产生了中和hpv l1的抗体igy(蛋黄免疫球蛋白)，从鸡蛋中提取得到18价hpv l1抗体igy，并制成多种制剂，实现了hpv的防治和宫颈癌的辅助治疗。

5、目前的研究证明原核细胞无蛋白质的翻译后加工系统(如蛋白的折叠、二硫键的正确形成)，产生的蛋白与天然构象不一致，保护作用不稳定、不可靠。由e.coli表达出的l1蛋白不能直接形成vlp，尽管通过变性、复性、再变性、再复性等复杂的操作也可形成一定量的vlp，但复性产率极低，仅有0.02％-0.04％，显然不能满足生产和研究所用，难以对l1-vlp的组装情况及分子生物学特性、免疫原性做出正确的估价。而真核细胞表达的蛋白，具有天然构象和生物学活性，在蛋白制备中可直接获得较大量的vlp，因此，本发明选择真核表达体系-杆状病毒-昆虫细胞表达系统作为研究工具。从genebank中查找hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1基因序列，设计技术路线和方法送专业公司，专业公司按照设计技术路线和方法进行基因合成、克隆，获得hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1的重组杆状病毒bacmid-l1，用它们分别感染sf9细胞，构建高效产生hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1vlp的系统，表达、纯化l1 vlp，获得hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1 vlp抗原。

6、本发明选择hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1vlp作为抗原。然后将hpv6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73l1vlp蛋白分别免疫产蛋母鸡，获得18价hpv复合卵黄中和抗体。

7、基于此，本发明提供了如下方案：

8、本发明提供一种用于18价hpv复合卵黄中和抗体的抗原组合的制备方法，包括以下步骤：选择并将编码氨基酸序列分别如seq id no.1-18所示的hpv6 l1蛋白、hpv11 l1蛋白、hpv16 l1蛋白、hpv18 l1蛋白、hpv31 l1蛋白、hpv33 l1蛋白、hpv35 l1蛋白、hpv39l1蛋白、hpv45 l1蛋白、hpv51 l1蛋白、hpv52 l1蛋白、hpv56 l1蛋白、hpv58 l1蛋白、hpv59 l1蛋白、hpv61 l1蛋白、hpv66 l1蛋白、hpv68 l1蛋白和hpv73 l1蛋白的基因，分别利用真核表达系统表达并自组装，再经分离，纯化，得到18种类病毒颗粒，即为所述抗原组合。

9、进一步地，所述真核表达系统为杆状病毒-昆虫细胞表达系统；

10、所述hpv6 l1蛋白、所述hpv11 l1蛋白、所述hpv16 l1蛋白、所述hpv18 l1蛋白、所述hpv31 l1蛋白、所述hpv33 l1蛋白、所述hpv35 l1蛋白、所述hpv39 l1蛋白、所述hpv45l1蛋白、所述hpv51 l1蛋白、所述hpv52 l1蛋白、所述hpv56 l1蛋白、所述hpv58 l1蛋白、所述hpv59 l1蛋白、所述hpv61 l1蛋白、所述hpv66 l1蛋白、所述hpv68 l1蛋白和所述hpv73l1蛋白昆虫细胞表达密码子优化的编码基因分别如seq id no.19-36所示。

11、进一步地，所述真核表达系统为杆状病毒-昆虫细胞表达系统。

12、本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的抗原组合。

13、本发明还提供上述的抗原组合在制备18价hpv复合卵黄中和抗体中的应用。

14、本发明还提供一种18价hpv复合卵黄中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

15、s1.分别上述的抗原组合中的18种类病毒颗粒作为抗原，分别免疫不同蛋鸡，从免疫后的蛋鸡生产的鸡蛋中获得18种蛋黄；

16、s2.将所述18种蛋黄混合后，进行卵黄中和抗体提取，得到所述18价hpv复合卵黄中和抗体。进一步地，在步骤s2中，所述提取的步骤包括：所述18种蛋黄混合后加入水，搅拌均匀后得到蛋黄液，之后调ph5.1-6.0，静置沉淀后离心得到上清，再经过去除杂蛋白和卵磷脂的处理后，浓缩干燥，即得到所述18价hpv复合卵黄中和抗体。

17、本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的18价hpv复合卵黄中和抗体。

18、本发明还提供上述的18价hpv复合卵黄中和抗体在制备防治hpv感染或辅助治疗宫颈癌的药物中的应用。

19、本发明还提供一种防治hpv感染或辅助治疗宫颈癌的药物，所述药物包括上述的18价hpv复合卵黄中和抗体。

20、进一步地，所述药物的剂型包括喷剂、口服含片、脂质体液晶微囊、阴道脂质体凝胶、外用洗液、栓剂、冻干粉或泡腾片。

21、进一步地，当所述药物为喷剂时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.1-0.8份、抑菌剂0.003-0.04份、甘油0.1-12份、防腐剂0.04-0.25份、溶菌酶0.05-1份和植物香精0.01-0.16份；

22、当所述药物为口服含片时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.15-0.8份、柠檬酸0.8-7份、木糖醇4-38份、淀粉38-52份、防腐剂0.03-0.7份和水溶性植物香精0.2-0.6份；

23、当所述药物为脂质体液晶微囊时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.5-2.5份、卵磷脂3-7.5份和胆固醇12-30份；

24、当所述药物为阴道脂质体凝胶时，按重量份计，原料包括以下组分：所述脂质体液晶微囊3-15份、依地酸二钠0.08-1份、卡波姆974p 0.2-2份、聚卡波非aa-10.03-0.6份、甘油1-12份、防腐剂0.04-0.25份、苯甲醇0.4-10份、三乙醇胺0.3-1.4份和植物香精0.01-0.05份；

25、当所述药物为外用洗液时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.1-0.8份、脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥铂酸单酯二钠28-37份、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵16-25份、甘油1.0-8份、防腐剂0.04-0.25份和植物香精0.016-0.13份；

26、当所述药物为栓剂时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.1-0.8份、明胶8-12份、甘油20-37份、甘露醇25-41份、防腐剂0.05-0.2份和植物香精0.02-0.1份；

27、当所述药物为冻干粉制剂时，按重量份计，所述冻干粉制剂的液体原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.1-0.8份、牛血清白蛋白0.009-0.18份、海藻糖1.5-13份、防腐剂0.04-0.2份和植物香精0.016-0.12份；

28、当所述药物为泡腾片时，按重量份计，原料包括以下组分：18价hpv复合卵黄中和抗体0.4-0.6份、羟丙基-β-环糊精30-34份、柠檬酸13-16份、硬脂酸镁2-4份、碳酸氢钠35-39份、聚乙二醇60003.5-4.5份、防腐剂0.05-0.1份和植物香精0.025-0.06份。

29、在制备18价hpv复合卵黄中和抗体制剂时，抑菌剂选用乳酸链球菌素，防腐剂选用山梨酸钾、葡萄糖酸氯已定和聚六甲基双胍中的一种或多种，其中：

30、(1)乳酸链球菌素(nisin)的作用就像一个表面活性剂，它对细菌的营养细胞及孢子都有作用。nisin对营养细胞的主要作用点是细胞质膜，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，从而使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，并造成细胞膜内容物外泄，严重地引起细胞裂解，在万分之三到万分之五的浓度即有明显抑菌作用。对芽孢的作用是在孢子出现膨胀的起始阶段抑制其发芽。nisin主要抑制大部分革兰氏阳性菌，特别是细菌的芽孢。nisin还能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种，抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢。

31、(2)聚六亚甲基胍为多胍类高分子聚合物，在水溶液中能产生电离，它的亲水基部分含有强烈的正电性，吸附通常呈负电性的各类细菌、病毒，进入细胞膜，抑制膜内脂质体合成，造成菌体凋亡，达到最佳的杀菌效果。比季铵盐类阳离子表面活性剂强，对真菌也有效，对组织无刺激性，被广泛地用于皮肤消毒，冲洗伤口及手术器械的浸泡及消毒。

32、(3)萄糖酸氯已定对革兰氏阳性菌比阴性菌的抗菌作用强，比季铵盐类阳离子表面活性剂强，对真菌也有效，对组织无刺激性，被广泛地用于皮肤消毒，冲洗伤口及手术器械的浸泡及消毒。

33、本发明公开了以下技术效果：

34、本发明制备得到了一种18价hpv复合卵黄中和抗体，其具有以下作用：

35、(1)阻断生殖道hpv感染，用于降低hpv载量，预防宫颈病变发生；促使hpv阳转阴；辅助治疗宫颈癌；

36、(2)阻断hpv感染，用于hpv感染引起的皮肤病变治疗，降低物理治疗后尖锐湿疣复发率。

37、本发明的18价hpv复合卵黄中和抗体可以制备成如喷雾剂、洗液、栓剂、凝胶、泡腾片、冻干粉、含片等，可以实现hpv的防治和对宫颈癌的辅助治疗，本发明开创了一种简便、安全、有效、卫生和经济的个性化的宫颈癌的防治方式。

38、本发明在三甲医院进行了人群临床试验，使用本发明的18价hpv复合卵黄中和抗体进行宫颈hpv感染的治疗，转阴率可达96.97％，可见本发明的18价hpv复合卵黄中和抗体能有效中和hpv病毒，进而可以有效防治宫颈癌。