一种用于重伞灵芝的特异性分子鉴别方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种用于重伞灵芝的特异性分子鉴别方法。

背景技术：

1、灵芝属是大型真菌的一个重要类群，具有重要的经济价值、生态价值和文化价值，其在分类上隶属于真菌界(fungi)、担子菌门(basidiomycota)、伞菌纲(agaricomycetes)、多孔菌目(polyporales)、多孔菌科(polyporaceae)。灵芝在中国已经有了两千多年的药用历史，中医学家认为灵芝具有补中益气、滋补强体、扶正固本、延年益寿等功效。灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、不饱和脂肪酸、生物碱、甾醇类物质等。其中灵芝多糖具有降“三高”、抗癌、提高免疫力等作用；灵芝三萜具有保肝排毒、抑制肿瘤细胞、抗hiv病毒、降低胆固醇、调血脂和抗炎等活性。

2、灵芝属重伞灵芝ganoderma multipileum ding hou是我国传统药用菌中的一种，可人工栽培，其菌丝生长速度快于主栽赤芝品种、多糖含量显著高于赤芝，且重伞灵芝三萜酸种类比赤芝丰富，具有潜在的利用价值。中国灵芝属真菌多样性丰富，其中多数是基于形态学鉴定的结果，近年来越来越多的研究证明灵芝真菌的形态分类容易受到外界环境的影响，形态数据难以准确区分不同种的菌株。随着分子生物学技术的不断发展，物种的分类鉴定从以形态观察为主到在分子水平上分析不同物种，线粒体基因组由于具备不产生重组且进化速率快、易于分析基因序列、相对保守等特点在进化生物学和系统发育学中常用来评估真菌的不同属、不同种之间的相互关系，为重伞灵芝灵芝区别于其他灵芝属真菌的鉴别提供了一个可靠的分子鉴定基础，也为重伞灵芝的研究、开发、管理和保护提供便捷的鉴定方法。

3、现有的灵芝分子鉴定技术主要是dna条形码技术。dna条形码鉴定技术体系除pcr技术外，还依赖dna测序技术和系统进化分析才能得出最终鉴定结果，鉴定过程所需的时间、价格成本较高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于重伞灵芝的特异性分子鉴别方法，解决现有灵芝分子鉴定时间长和成本高的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一组用于重伞灵芝特异性分子鉴别的分子标记，其核苷酸序列如seq idno.1，seqid no.4，seq id no.7，seq id no.10，seq id no.13，seq id no.16，seq id no.19，seqid no.22。

4、2.权利要求1所述的一组用于重伞灵芝特异性分子鉴别的分子标记的特异性引物，其特征在于：

5、所述用于扩增seq id no.1的特异性引物组合为atp6_f/atp6_r，即seq id no.2/seq id no.3，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

6、seq id no.2：tgctagataccctctctcccaa

7、seq id no.3：ctctgccccagttatacccac；

8、所述用于扩增seq id no.4的特异性引物组合为cob_f/cob_r，即seq idno.5/seqid no.6，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

9、seq id no.5：agagtaggacagcacagggt

10、seq id no.6：tggaagtaggtgggggttatt；

11、所述用于扩增seq id no.7的特异性引物组合为cox1_f/cox1_r，即seq id no.8/seq id no.9，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

12、seq id no.8：acgtgggaaaactgtaagtggt

13、seq id no.9：agacccgattaaaggcacaagt；

14、所述用于扩增seq id no.10的特异性引物组合为cox2_f/cox2_r，即seq idno.11/seq id no.12，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

15、seq id no.11：tttttaagatgtaacttaggatgcctt

16、seq id no.12：tcagacaaccgagattctacact；

17、所述用于扩增seq id no.13的特异性引物组合为cox3_f/cox3_r，即seq idno.14/seq id no.15，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

18、seq id no.14：ggattactatcctactcccctct

19、seq id no.15：agcttatcctttgggtacttgtaa；

20、所述用于扩增seq id no.16的特异性引物组合为nad3_f/nad3_r，即seq idno.17/seq id no.18，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

21、seq id no.17：atttagtatggcaggagtacctc

22、seq id no.18：tacagtagggttggatcgcatg；

23、所述用于扩增seq id no.19的特异性引物组合为nad4_f/nad4_r，即seq idno.20/seq id no.21，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

24、seq id no.20：gccaaacgccacatgatcat

25、seq id no.21：tcttgggtatcggtgttcca；

26、所述用于扩增seq id no.22的特异性引物组合为nad6_f/nad6_r，即seq idno.23/seq id no.24，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

27、seq id no.23：acgaccaaactagaaatataacacaca

28、seq id no.24：acaagggattcactccgtgac。

29、一种用于重伞灵芝的特异性分子鉴别方法，所述方法包括如下步骤：

30、步骤1：获取重伞灵芝保守核苷酸序列分子标记物的特异性引物组合f/r；

31、步骤2：提取待测灵芝样品dna为模板，分别以特异性引物组合f/r进行pcr扩增反应；

32、步骤3：反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，出现f/r引物扩增产物特异性条带的样品为灵芝属重伞灵芝。

33、进一步地，步骤1的具体规程为：

34、步骤1.1：使用dna抽提试剂盒提取经过形态学鉴定的灵芝属真菌各菌株样本的总dna，用dna条形码技术进行分子鉴定，pcr扩增使用真菌通用引物its1：5’tccgtaggtgaacctgcgg3’和its4：5’tcctccgcttattgatatgc3’；

35、步骤1.2：将扩增产物进行dna测序，测序的dna序列用于系统进化分析；

36、步骤1.3：将测序获得的dna数据用geneious 9.1.8软件进行预处理，系统进化分析先用mafft程序对基因序列进行多重比对，将序列比对结果导入jmodeltest程序用于筛选核苷酸替代矩阵，再用phyml程序生成ml最大似然树，完成样本的分类鉴定，确证样本为灵芝属真菌；

37、步骤1.4：开展灵芝属真菌线粒体全基因组测序，应用hiseq 2500illumina平台对其进行全基因测序；

38、步骤1.5：根据ncbi中已报道的灵芝属线粒体基因组为参考，测序数据采用geneious 9.1.8软件并结合pcr的方法完成线粒体基因组的组装和功能注释；

39、步骤1.6：利用geneious 9.1.8软件对灵芝属真菌线粒体基因组进行snp分析，根据各样本的snp差异位点筛选高度保守的重伞灵芝核苷酸序列分子标记物；

40、步骤1.7：完成标记物的特异性引物设计，经过pcr验证，获得与重伞灵芝核苷酸序列分子标记物相对应的特异性引物f和r。

41、进一步地，步骤2中pcr反应体系为：

42、10×pcr buffer:2.5μl；

43、dntp 10mmol/l：0.5μl；

44、引物f10μmol/l：1μl；

45、引物r10μmol/l：1μl；

46、mg2+25mmol/l：5μl；

47、dna模板0.1μg/μl：1μl；

48、dna聚合酶5u/μl：0.2μl；

49、ddh2o：补加至终体积25μl。

50、进一步地，步骤2中pcr反应程序为：预变性94℃，5min，变性94℃，0.5min，35循环，退火55℃，0.5min，35循环，延伸72℃，1min，35循环，后延伸72℃，10min，低温保存4℃，30min。

51、进一步地，步骤3中琼脂糖凝胶电泳检测条件为：用微量移液器将dna maker和pcr产物分别加样于质量体积比1.5-2.0％的琼脂糖凝胶加样孔，3-5v/cm,电泳30-45min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察。

52、本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

53、(1)本发明提供1组分子标记物，即重伞灵芝的特异性核苷酸序列，利用该特异性核苷酸序列能够将重伞灵芝与灵芝属其他种区分开来，有利于重伞灵芝的鉴定、保护和开发。

54、(2)本发明进一步开发的核苷酸引物能够有效扩增重伞灵芝的特异性核苷酸序列分子标记物，通过pcr方法能够扩增出这段核苷酸序列的样品即可认为是重伞灵芝，无需再进行dna序列测定和系统进化树的构建，为重伞灵芝的筛选与鉴定提供了一种便捷、准确的分子鉴定方法。