同时检测肺癌和结直肠癌的DNA和RNA流程引物组和试剂盒的制作方法

本技术涉及基因检测领域，具体地，涉及一种同时检测肺癌和结直肠癌的引物组，还涉及一种同时检测肺癌和结直肠癌的试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、肺癌和结直肠癌均是世界范围内常见的恶性肿瘤。世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)的数据显示：2020年全球肺癌和结直肠癌的新发病例分别占总癌症新发病例数的11.4％和10％，位居第二和第三；死亡病例分别占总癌症死亡病例的18％和9.4％，位居第一和第二。在我国，肺癌和结直肠癌发病率分别位居第一(17.9％)和第二(12.2％)，死亡率分别为第一(23.8％)和第五(9.5％)。这两种恶性肿瘤已严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一。因此，对于肺癌和结直肠癌进行治疗，以提高患者的生存率和生活质量非常重要。

2、目前，传统的针对肺癌和结直肠癌的治疗方法，主要有手术、放疗与全身化疗。随着分子诊断技术不断发展，针对肺癌和结直肠癌的诊疗已进入靶向治疗和免疫治疗时代，并且在临床上已取得良好的效果。以肺癌为例，肺癌按组织学类型可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，sclc)，分别占85％和15％左右。在我国，大部分肺癌患者确诊时已处于中晚期，肿瘤已发生局部扩散或远处转移，丧失手术机会，5年生存率很低。目前，肺癌的一线治疗方案仍是以铂类药物为基础的联合化疗，但携带一些基因变异的部分患者对化疗药物的敏感性和耐受性不同，导致不同患者使用化疗药物的效果不一或使用超过耐受剂量的药物会造成较大的毒副作用。

3、高通量测序技术也称为下一代测序技术(next generation sequencing，ngs)，可实现一次对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行测序，获得基因变异信息。利用ngs技术对化疗相关位点进行检测，可为患者提供个体化化疗药物有效性及毒副作用预测信息。随着靶向药物的开发，近10年来，利用ngs技术对靶向基因位点进行检测，进而指导靶向治疗的诊疗模式已在临床应用上获得良好效果；对于驱动基因阴性患者，可以选择化疗或免疫治疗等；对于驱动基因阳性患者，则可选择靶向用药治疗。常见的nsclc驱动基因如表皮生长因子受体(egfr)、间变性淋巴瘤激酶(alk)等已有相应的分子靶向药物，它们均可延长患者疾病控制时间及总生存时间，使部分患者获益。此外，随着肿瘤免疫学的迅速发展，免疫治疗也逐渐引起重视，被认为是最有希望治愈恶性肿瘤的治疗手段；利用ngs技术对免疫治疗靶点进行检测，再利用该免疫靶点对应的免疫检查点抑制剂(如pd-1单抗或pd-l1单抗等)对患者进行免疫治疗，已被证实可改善肺癌患者的生存率。同样，结直肠癌的专家共识也推荐结直肠癌患者可采用ngs技术进行基因检测，获得化疗位点，靶向位点和免疫靶点的相关基因信息，从而获得用药指导和预后评估信息，以提高患者的5年生存率及生活质量。因此，开发一款覆盖多种用药信息，成本低，效率高的肺癌和结直肠癌基因ngs检测产品是必要的，能够为临床医生及患者提供实时、有效的靶向、免疫或化疗用药指导、预后评估等信息，使患者受益。

4、目前，中华医学会肺癌临床诊疗指南(即csco指南，2022版)推荐了nsclc检测的必检基因，包括egfr、alk、ros1、ret、braf v600e和met 14外显子跳跃突变，扩展基因包括met、her-2、kras、ntrk等。此外，nccn指南推荐转移性结直肠癌患者进行msi检测、kras和braf等基因突变检测，ret、ntrk等融合基因检测。其中，alk、ros1、ret和ntrk等基因主要表现为基因重排/融合。然而，目前的大部分的ngs技术仅对以上的部分基因进行dna层面的突变的检测，但是没有对于融合基因进行检测。rna测序能够有效避免这些融合的漏检，包括metexon 14跳跃突变。一般市售基因检测产品针对肺癌和结直肠癌只能分开两种试剂盒和流程进行检测，但实际上肺癌和结直肠癌存着很多共同的基因需要检测，例如kras、braf、tp53等，使用两种不同的试剂流程进行建库，操作的时间长，人力成本和材料成本高。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，有必要开发一种基于多重pcr技术，同时进行dna和rna建库和靶向测序的肺癌、结直肠癌基因变异的引物组、试剂盒及方法，以快速简单、低成本的完成肺癌、结直肠多基因突变的检测。

2、本技术提供一种引物组，包括检测egfr、braf、met、erbb2、akt1、apc、kras、map2k1、nras、pik3ca、pten、pole、rb1、tp53、dpyd、ugt1a1、pdgfra、kit基因突变的dna引物组，和检测alk、ros1、ret、ntrk1、ntrk2、ntrk3基因融合及met外显子跳跃的rna引物组。

3、本技术所述的dna引物，或称dna流程引物，指其扩增模板是dna；本技术所述的rna引物，或称rna流程引物，指其扩增模板是由rna逆转录得到的cdna。

4、作为优选，所述dna引物组由具有seq id no：1-314所示序列的引物组成。

5、作为进一步的优选，具有seq id no：1-314所示序列的引物在所述dna引物中的占比分别为：

6、(1)第一dna引物分组，包括seq id no：49、50、57、58、119、120、137、138、145、146、151、152、153、154、159、160、305、306所示的引物，每条引物占比为0.138％；

7、(2)第二dna引物分组，包括seq id no：39、40、43、44、111、112、113、114、117、118、121、122、133、134、139、140、141、142、155、156、173、174、181、182、183、184、187、188、189、190、195、196、301、302、303、304所示的引物，每条引物占比为0.207％；

8、(3)第三dna引物分组，包括seq id no：19、20、21、22、23、24、25、26、31、32、35、36、41、42、47、48、51、52、53、54、55、56、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、89、90、91、92、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、125、126、143、144、147、148、149、150、157、158、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、175、176、177、178、191、192、199、200、203、204、235、236、239、240、243、244、283、284、285、286、307、308、309、310、311、312、313、314所示的引物，每条引物占比为0.276％；

9、(4)第四dna引物分组，包括seq id no：3、4、7、8、13、14、15、16、17、18、27、28、33、34、37、38、45、46、61、62、63、64、81、82、83、84、87、88、95、96、97、98、99、100、115、116、123、124、127、128、129、130、131、132、135、136、171、172、179、180、185、186、197、198、201、202、207、208、209、210、211、212、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、241、242、247、248、263、264、265、266、267、268、269、270、273、274、277、278、281、282、287、288、289、290、291、292、295、296、299、300所示的引物，每条引物占比为0.345％；

10、(5)第五dna引物分组，包括seq id no：1、2、5、6、29、30、67、68、193、194、231、232、233、234、237、238、251、252、255、256、257、258、297、298所示的引物，其中每对引物占比为0.414％；

11、(6)第六dna引物分组，包括seq id no：9、10、11、12、59、60、65、66、85、86、93、94、205、206、213、214、215、216、217、218、245、246、249、250、253、254、259、260、261、262、271、272、275、276、279、280、293、294所示的引物，每条引物占比为0.483％。

12、作为优选，所述rna引物组由具有seq id no：315-424所示序列的引物组成。

13、作为进一步的优选，seq id no：315-424所示的每种引物在所述rna引物组中的占比为0.909％。

14、作为另一种优选的实施方式，所述seq id no编号为奇数的dna引物，和seq id no为315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、356、358、360、362、363、364、366、368、369、370、371、373、375、376、378、380、381、383、384、386、387、389、391、392、395、396、397、398、399、401、402、403、404、406、407、408、410、411、413、415、416、421、422、423的rna引物，还具有seq id no：425所示的接头；seq id no编号为偶数的dna引物，和seq id no为316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、357、359、361、365、367、372、374、377、379、382、385、388、390、393、394、400、405、409、412、414、417、418、419、420、424的rna引物，还具有seq id no：426所示的接头。

15、本领域技术人员容易理解的是，seq id no编号为奇数的dna引物，即编号为1、3、5、7、9……313的157条dna引物，seq id no编号为偶数的则是编号为2、4、6、8、10……314的157条dna引物。

16、本技术还提供一种试剂盒，包括权利要求1-6任一项所述的引物组。

17、作为一种变形的实施方式，所述试剂盒中，还包括逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂。由于逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂是本领域的现有技术，已有多种市售试剂，选择何种试剂对实施本技术的技术方案没有实质性影响，本技术中不再详细限定其组成和含量。

18、本技术还提供一种检测肺癌和/或结肠癌基因突变的方法，利用本技术所述的引物组或试剂盒，对待测样本通过ngs法测序。

19、作为优选的一种检测肺癌和/或结肠癌基因突变的方法，针对所述待测样本，同时提取dna和rna，分离所提取的dna和rna后，对分离得到的dna和rna分别建库和测序。

20、本技术中的her2基因，也称为erbb2基因，二者具有相同的含义。

21、本技术中的试剂，如无特别说明，均采用市售试剂。

22、本技术克服了多重pcr法建库中存在的均一性低、产生较多非特异性扩增等缺陷，可在提取同一样本的dna和rna的基础上，使用统一试剂盒和流程分别进行dna和rna水平的建库，并一同上机测序，同时获得肺癌和结直肠癌的基因突变和基因融合的测序信息及用药指导信息。