特异性靶向人pro-TGFβ3/LTBP3复合物的纳米抗体

本发明涉及抗原检测领域，具体地，涉及特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体。

背景技术：

1、转化生长因子β(transforming growth factor beta,tgfβ)是多能细胞因子，在细胞的增殖、分化、发育和凋亡以及机体的免疫调节和组织稳态平衡中都具有非常重要的作用，此外还与血管生成、上皮细胞转化为间充质、调节免疫稳态、耐受、炎症、纤维化疾病，肿瘤免疫逃逸等密切相关。近年来，已经有大量关于tgfβ上游调控机制的公开报道，即tgfβ与受体结合之前的调控。但是针对tgfβ下游信号通路的报道不能够完全解释为什么tgfβ结合同样的细胞表面受体却能在机体内行使多种不同的功能。与其他生长因子不同的是，tgfβ以非活性前体pro-tgfβ形式合成、分泌并储存在细胞外基质或锚定在细胞表面的。pro-tgfβ由n端pro结构域(prodomain)和c端生长因子结构域(growth factor domain)组成，在内质网合成并发生二聚化；转运至高尔基体时会发生弗林蛋白酶(furin)水解，但是此时prodomain仍与tgfβ存在较强的非共价作用，生长因子结构域不能与受体结合行使功能，在pro-tgfβ分泌的过程中还会与tgfβ呈递蛋白如非活性结合蛋白(ltbp)、富含亮氨酸重复序列的膜蛋白lrrc32(garp)和lrrc33(nrros)共价结合，以大型前体复合物的形式储存在细胞外基质或特定的细胞表面。ltbp将pro-tgfβ锚定储存在细胞间质中，lrrc32(garp)将pro-tgfβ呈递在treg、肿瘤细胞、内皮细胞和血小板上，而lrrc33(nrros)则能够特异性地将pro-tgfβ1呈递在巨噬细胞和小胶质细胞表面，进而激活，在机体行使特定的生理功能。pro-tgfβ在不同组织微环境的合成、定位以及激活机制的不同才是决定tgfβ生理功能不同的关键因素。

2、哺乳动物中tgfβ有三种亚型，即tgfβ1、tgfβ2以及tgfβ3，这三种亚型都能与细胞表面的tgfβii型受体结合，ii型受体磷酸化后结合tgfβi型受体，而后磷酸化下游蛋白，传递信号，调节细胞内多种生理功能。tgfβ三种亚型在机体内行使着不同的功能，tgfβ被认为是纤维化的关键调节因子，其中tgfβ1和tgfβ2具有促纤维化作用并促进纤维增生，而tgfβ3具有抗纤维化作用并减少疤痕形成。此外tgfβ3突变与心血管疾病相关，包括主动脉瘤、夹层、二尖瓣疾病以及与loeys-dietz、shprintzen-gold berd和marfan综合征重叠的系统性特征。tgfβ3在免疫中发挥着不同于tgfβ1的功能，tgfβ3诱导分化病理性th17导致多发性硬化症(ms)、类风湿性关节炎(ra)及炎症性肠病(ibd)等多种自免疫疾病的发生。在lag3+treg细胞中，通过调节ltbp3的表达特异性调节tgfβ3的分泌，抑制b细胞的异常发育，进而预防系统性红斑狼疮疾病(sle)的发生。在lag3+treg细胞中，调节tgfβ3表达分泌的ltbp3是pro-tgfβ的胞外定位蛋白。除此之外，tgfβ3在机体发育中的功能与ltbp3密切相关，ltbp3敲除小鼠表现出与tgfβ3敲除小鼠极为相似的腭裂及肺部发育障碍等表型。ltbp3在人体中功能缺失表现出身材矮小、脊柱弯曲、颅面畸形、远端关节萎缩和牙齿异常等表型与tgfβ3在人体中功能缺失的表型类似。此外，通过对病人进行全基因组连锁分析显示ltbp3在人体内突变与tgfβ3在人体内自然突变表现出相同的以胸主脉瘤和夹层为主的病理特征。ltbp3在脂肪生成中的重要作用具有tgfβ依赖性；而在tgfβ1、β2、β3中，只有tgfβ3介导脂肪祖细胞分化诱导脂肪生成。tgfβ3pro-tgfβ3与ltbp3的结合分泌定位到特定组织微环境发挥相关的功能，因此pro-tgfβ3/ltbp3复合物的组织特异性分布是其发挥功能的关键。

3、目前现有技术中，pro-tgfβ3的抗体只能结合pro-tgfβ3，尚未有针对人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的特异性抗体，不能用于检测样品中复合物蛋白的存在，也不能在细胞表面，组织微环境中特异性检测pro-tgfβ3/ltbp3，不能用于pro-tgfβ3/ltbp3的胞外定位的研究，同时也无法用于pro-tgfβ3/ltbp3相关疾病病理组织的染色以及组织中提取的pro-tgfβ3/ltbp3复合物的检测。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺少靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的特异性抗体的问题，本发明提供了特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体。

2、本发明的第一个目的是提供一种特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体。

3、本发明的第二个目的是提供上述纳米抗体在制备检测人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的试剂盒中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供一种编码特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体的核苷酸分子。

5、本发明的第四个目的是提供一种制备特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体的方法。

6、本发明的第五个目的是提供上述方法制得的纳米抗体。

7、本发明的第六个目的是提供一种检测人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的免疫分析方法。

8、本发明的第七个目的是提供一种检测人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的试剂盒。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

10、本发明提供一种纳米抗体，通过三个特定的抗原结合互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)特异性识别pro-tgfβ3/ltbp3复合物上特有的表位，从而达到特异性识别pro-tgfβ3/ltbp3共价复合物，而不识别pro-tgfβ3或ltbp3单体，或其他相关亚型蛋白复合物如人pro-tgfβ1/ltbp3或pro-tgfβ1/ltbp1的目的。本发明中所述pro-tgfβ3/ltbp3复合物即为pro-tgfβ3蛋白和ltbp3蛋白的结合体。本发明中涉及纳米抗体的英文表述时均使用nanobody代指。

11、一种特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体，所述纳米抗体包含互补决定区cdr1～cdr3，其中cdr1的氨基酸序列如seq id no.6所示，cdr2的氨基酸序列如seqid no.10所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.14所示。

12、优选地，所述纳米抗体还包含框架区fr1～fr4，其中fr1的氨基酸序列如seq idno.4所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.12所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.16所示；所述fr1～fr4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列。

13、更优选地，所述纳米抗体还包含框架区fr1～fr4，其中fr1的氨基酸序列如seq idno.4所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.12所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.16所示；所述fr1～fr4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列。

14、进一步优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

15、所有基于上述抗原识别互补决定区cdr1(seq id no.6)、cdr2(seq id no.10)以及cdr3(seq id no.14)这个三个cdr氨基酸序列的抗体，包括对该三个cdr区域进行突变或序列替换(整体序列同源性高于90％)，以及在该纳米抗体基础上对其n端c端进行包括但不限于fc、his标签、egfp蛋白或者其他肽段标签等常规的融合改造，在均在本发明的保护范围之内。

16、任一上述纳米抗体在制备检测pro-tgfβ3/ltbp3复合物的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

17、一种编码特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体的核苷酸分子，所述核苷酸分子编码任一上述纳米抗体。

18、优选地，所述纳米抗体包含互补决定区cdr1～cdr3，其中cdr1的氨基酸序列如seqid no.6所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.14所示；所述核苷酸分子中，编码cdr1的片段的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码cdr2的片段的核苷酸序列如seq id no.9所示，编码cdr3片段的核苷酸序列如seq id no.13所示。

19、更优选地，所述核苷酸分子编码的纳米抗体还包含框架区fr1～fr4，其中fr1的氨基酸序列如seq id no.4所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.12所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.16所示；所述fr1～fr4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列；其中编码fr1的片段的核苷酸序列如seq id no.3所示，编码fr2的片段的核苷酸序列如seq id no.7所示，编码fr3的片段的核苷酸序列如seq idno.11所示，编码fr4的片段的核苷酸序列如seq id no.15所示。

20、进一步优选地，所述核苷酸分子编码氨基酸序列如seq id no.2所示的纳米抗体，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

21、所有基于编码上述抗原识别互补决定区cdr1(seq id no.5)、cdr2(seq id no.9)以及cdr3(seq id no.13)的核苷酸序列，包括对该核苷酸序列进行同义替换，或者异义突变(所编码cdr1～cdr3的氨基酸序列整体同源性高于90％)，以及在该纳米抗体核苷酸序列添加编码包括但不限于fc、his标签、egfp蛋白或者其他肽段标签的核苷酸序列的修饰改造，在均在本发明的保护范围之内。

22、一种重组表达载体，所述重组表达载体为连接有编码基因的载体，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

23、本发明对用于连接编码基因构建重组表达载体的载体种类没有特殊限定，包括但不限于pet-26b(+)载体、pcdna3.4载体、pd2529载体等常规用于表达编码基因的真核或原核载体均可实现本发明的目的。

24、优选地，所述载体为pet-26b(+)载体。

25、一种重组细胞，所述重组细胞为携带有上述重组表达载体的宿主细胞。

26、本发明对宿主细胞的来源和种类没有特殊限定，包括但不限于大肠杆菌、hek293细胞、cho细胞等常规可以携带所述重组表达载体的原核与真核细胞均可实现本发明的目的。

27、优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

28、更优选地，所述大肠杆菌为菌株bl21(de3)。

29、一种制备特异性靶向人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的纳米抗体的方法，将任一上述核苷酸分子构建至表达载体，得到重组表达载体；再将所得重组表达载体转入宿主细胞，得到重组细胞；所得重组细胞经过诱导表达，即得所述纳米抗体。

30、优选地，所述纳米抗体包含互补决定区cdr1～cdr3，其中cdr1的氨基酸序列如seqid no.6所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.14所示；所述核苷酸分子中，编码cdr1的片段的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码cdr2的片段的核苷酸序列如seq id no.9所示，编码cdr3片段的核苷酸序列如seq id no.13所示。

31、更优选地，所述核苷酸分子编码的纳米抗体还包含框架区fr1～fr4，其中fr1的氨基酸序列如seq id no.4所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.12所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.16所示；所述fr1～fr4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列；其中编码fr1的片段的核苷酸序列如seq id no.3所示，编码fr2的片段的核苷酸序列如seq id no.7所示，编码fr3的片段的核苷酸序列如seq idno.11所示，编码fr4的片段的核苷酸序列如seq id no.15所示。

32、进一步优选地，所述核苷酸分子编码氨基酸序列如seq id no.2所示的纳米抗体，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

33、优选地，所述表达载体为pet-26b(+)载体。

34、优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

35、更优选地，所述大肠杆菌为菌株bl21(de3)。

36、优选地，所述诱导表达的方法为用异丙基硫代半乳糖苷诱导。

37、根据任一上述方法制备得到的纳米抗体也应在本发明的保护范围之内。

38、一种检测人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的免疫分析方法，使用任一上述的纳米抗体作为检测抗体对待测样品进行免疫分析。

39、所述免疫分析的方法包括但不限于流式细胞术、免疫荧光、elisa和免疫沉淀检测方法。

40、优选地，所述免疫分析的方法为流式细胞术和/或elisa。

41、一种检测人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的试剂盒，含有任一上述的纳米抗体。

42、优选地，所述纳米抗体修饰有荧光蛋白。

43、更优选地，所述纳米抗体修饰有增强绿色荧光蛋白。

44、进一步优选地，所述增强绿色荧光蛋白修饰的方法为：在所述纳米抗体的c端添加一段氨基酸序列如seq id no.30所示且核苷酸序列如seq id no.31所示的柔性linker以及增强绿色荧光蛋白。

45、优选地，还包括facs buffer、anti-ha-iflour647和streptavidin-pe，用于流式细胞术。

46、优选地，还包括pro-tgfβ3/ltbp3蛋白、辣根过氧化物酶标记的二抗，用于elisa检测；所述pro-tgfβ3/ltbp3蛋白由ltbp3分泌表达载体和与ltbp共表达的pro-tgfβ3分泌表达载体共同转染至宿主细胞，经过表达，收集上清，经过纯化后得到；

47、所述ltbp3分泌表达载体为表达ltbp3截短体的重组表达载体，所述ltbp3截短体为egf-tb3-egf结构域(uniprot:q9ns15)的第865～1035位氨基酸，对应dna序列为nc_000011.10第2593bp～3105bp(即seq id no.20)，所述ltbp3截短体的n端连接有kozak序列“gccgccacc”以及核苷酸序列如seq id no.18所示的信号肽，所述ltbp3截短体的c端连接有nhei的酶切位点、核苷酸序列如seq id no.21所示的hrv 3c蛋白酶识别序列、核苷酸序列如seq id no.22所示的一柔性linker、flag标签、核苷酸序列如seq id no.23所示的第二柔性linker以及10×his标签；

48、所述与ltbp共表达的pro-tgfβ3分泌表达载体为表达pro-tgfβ3蛋白的重组表达载体，所述pro-tgfβ3蛋白的编码核苷酸序列如seq id no.17所示，pro-tgfβ3蛋白的弗林蛋白酶酶切位点的氨基酸“rkkr”突变为“gs”，其n端连接有kozak序列“gccgccacc”以及核苷酸序列如seq id no.18所示的信号肽。

49、更优选地，所述ltbp3分泌表达载体以pd2529载体为骨架，其中ecori和noti之间连接有核苷酸序列如seq id no.24所示的ltbp3分泌表达片段。

50、更优选地，还包括酶标板、封闭液、显色剂、终止液和洗涤液。

51、进一步优选地，所述酶标板包被有所述pro-tgfβ3/ltbp3蛋白。

52、进一步优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗包括anti-his-hrp。

53、进一步优选地，所述封闭液包括含3％w/v牛血清白蛋白和2％w/v脱脂奶粉的pbs。

54、进一步优选地，所述显色剂包括tmb底物。

55、进一步优选地，所述洗涤液包括含0.05％v/v tween 20的pbs。

56、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

57、本发明提供的纳米抗体，可特异性结合人pro-tgfβ3/ltbp3复合物，且不与pro-tgfβ3的单体蛋白和ltbp3的单体蛋白发生非特异性结合。该纳米抗体不仅能够用于人pro-tgfβ3/ltbp3复合物的检测(如elisa，流式分析等)，还能辅助对pro-tgfβ3/ltbp3复合物的生物学研究。