一种将ND-FISH与GISH结合的百合杂交种鉴定方法

本发明涉及生物基因工程检测，具体涉及一种将nd-fish与gish结合的百合杂交种鉴定方法。

背景技术：

1、百合(lilium.spp)是一类具有很高观赏价值和经济价值的植物，其花朵美丽、花期较长，是世界上重要的切花和花卉市场品种之一。百合的良种繁育是提高其观赏品质和经济价值的关键，杂交是一种常见的育种手段，通过将具有优良性状的亲本进行杂交，可以创造出更多具有优良性状的新品种。为了确保杂交品种的品质及其亲本的来源，对杂交种进行准确鉴定是至关重要的。

2、目前，对于百合杂交种的鉴定方法主要有形态学观察、生化方法(如同工酶分析)、分子生物学方法(如分子标记技术)。然而，这些方法存在一定的局限性，如形态学观察容易受环境因素影响，同工酶分析和分子标记技术可能无法区分某些近缘杂交种。而传统的染色体研究方法如核型分析、染色体计数等，虽然可以了解植物的染色体基本特征，但在杂交种鉴定方面存在局限性，如无法区分百合染色体中大量的近端染色体，且对制备染色体技术要求较高。随着分子生物学技术的发展，fish(fluorescenceinsituhybridization)和gish(genomicinsituhybridization)等染色体分子标记技术应运而生。这些技术具有较高的灵敏度和特异性，可以在细胞和染色体水平上对植物进行精确鉴定。

3、目前在百合杂交种的细胞学鉴定方面，仍然是以fish和gish为主，普遍认为gish技术更加适用于百合组间杂交的后代鉴定。fish技术主要包括探针提取与合成、探针标记、杂交、洗涤和观察，现有的fish技术主要的缺点体现在技术繁琐、时间花费长、成本高等。fish技术需要通过引物提取出需要的dna片段，并采用缺刻平移法等对该片段进行标记，杂交过程复杂且花费大量时间和精力，且染色体在通过高温变性后不能再次使用，因此在标记大量探针的情况下会进行大量的重复工作，还因为染色体在fish技术会高温变性而无法和gish技术联合使用。而单一的fish技术只能观测到同一分裂相中的标记染色体无法观测到到重组现象，单一的gish染色体也只能检测到同一分裂相中的重组染色体，无法观察到其中的标记染色体。染色体由于制片技术的差异，染色体的形状和大小都会出现变化，且百合中存在大量的近端染色体，因此在百合染色体中，近端染色体很难通过染色体测量技术进行识别。以上两种技术单独使用时均不能准确判断染色体的来源，且无法进行染色体定位，百合杂交种的鉴定技术亟待克服上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种将nd-fish与gish结合的百合杂交种鉴定方法，以解决现有百合杂交种鉴定技术不能准确判断染色体的来源、无法进行染色体定位的技术难题。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种将nd-fish与gish结合的百合杂交种鉴定方法，用于百合组间杂交种的鉴定，包括如下步骤：

4、(1)发根及预处理：剪取待检测百合的根，并置于有孔且湿润的离心管中，采用笑气处理2～3h后，加入90％醋酸并于冰上固定10-15min，固定后的根用ddh2o清洗3～5次，加入70％酒精，于-20℃冰箱保存备用；

5、(2)采用根尖中期细胞染色体进行制片：将步骤(1)中保存的根取出，用ddh2o清洗3-5次，加入适量ddh2o保持根的湿润状态，使用镊子将根取出并于滤纸上吸干水分，用刀片切下根尖分生区组织，放入预先准备好的2％纤维素酶和1％果胶酶混合液中，35～40℃水浴50～60min，酶解后的根尖立即转移到冰上放置，用70％酒精洗3～5次，再加入100μl的70％酒精，然后使用电动组织研磨器将根尖磨碎，3500r/min离心3min，倒掉酒精，倒扣于纸上晾干剩余酒精；接合管内根尖数，按照每个1个根尖加28μl冰醋酸的加料比加入冰醋酸，并且涡旋充分混匀；取10μl悬液滴在洁净载玻片上，并置于已经用水喷湿的片盒中自然晾干；然后在普通相差显微镜下观察有丝分裂中期细胞染色体，并用铅笔在载玻片侧面标记好分裂相的位置，保留分裂相较好的玻片；用紫外交联仪进行交联后，应用塑封袋包装好后，置于-20～4℃冰箱保存；

6、(3)nd-fish鉴定：在已知目的基因的前提下，选取重复序列选择30-57bp作为寡核苷酸探针序列，并利用tamra或fam荧光基团在5’端进行修饰得到探针干粉，将探针干粉于12000r/min离心3min，按照1od加100μl1×te溶液的加料比加1×te溶液进行溶解，得到100×的探针原液，然后用2×ssc：1×te＝1:1buffer将100×探针原液稀释成1000×的寡核苷酸探针工作液备用；

7、根据杂交体系，取对应量的寡核苷酸探针工作液加入buffer中，充分混匀，以制成探针杂交液，将10μl探针杂交液滴加到玻片上有分裂相的区域，迅速盖上盖玻片，放进提前预热好的湿润密闭铝盒中，置于42℃恒温培养箱中杂交2h；杂交后的玻片用42℃预热的2×ssc溶液洗脱液进行洗脱，并用洗耳球迅速吹干玻片；在分裂相所在区域滴加8μl的dapi抗褪色剂进行复染，盖上盖玻片；最后用荧光显微镜观察分裂相，并进行拍照以及图片合成；

8、(4)染色体清洗：用75％酒精将已经拍摄完的玻片中含有分裂相的部位的dapi抗褪色剂洗掉，并用洗耳球吹干，以便后续进行gish试验；

9、(5)探针标记：提取目的dna和封阻dna；避光条件下采用德国的jenabioscience荧光探针–蛋白标记试剂盒对目的dna进行标记得到目的基因组探针；

10、(6)gish鉴定：

11、首先，将步骤(4)清洗后的片子依次洗涤或放紫外交联仪处理一遍，洗涤过程为：用2×ssc洗5min，3:1的无水乙醇/醋酸洗10min再继续利用2×ssc洗两遍，每遍洗5min，4％formaldehydesolution洗10min，2×ssc洗3遍，每遍5min，70％、85％90％梯度酒精各洗1min；

12、然后在避光条件下进行如下操作：将0.7ul目的基因组探针加入9.3ul杂交液并混匀得到混合液，所述杂交液由1g硫酸葡聚糖钠盐、2mlddh20、5mlfa、1ml20×ssc、1ml鲑鱼精dna组成；将混合液90℃变性10min，随后立即将混合液冰埋，待混合液温度降至室温以下后，加入3ul封阻基因组混匀，将13ul的混合液滴到玻片上，加盖盖玻片，将片子85℃变性5min，随后50℃孵化过夜，第二天50℃下采用2×ssc洗10min，洗的过程中每隔3分钟将片子上下涮一下，随后利用ddh20和无水乙醇各洗1min晾干滴加8uldapi抗褪色剂，加盖盖玻片后镜检拍照；

13、(7)采用imageproplus软件对步骤(3)以及步骤(6)所得图片进行测量，并根据测量结果，利用powerpoint进行染色体模型图的绘制，根据模型图精确定位亲本染色体和重组染色体情况。

14、作为优选地，步骤(1)中，剪取待检测百合根的前一天对百合进行浇水，并于当天早上8：00-10：00之间剪切盆栽中根长2-4cm的幼根。

15、作为优选地，所述dapi抗褪色剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

16、作为优选地，步骤(3)中选取的寡核苷酸探针命名为oliga-794，其如seq id no.1所示：

17、oligo-pta794：5'-tcagaactccgaagttaagcgtgcttgggcgagagtagtac-3'。

18、作为优选地，步骤(5)中所述德国的jenabioscience荧光探针–蛋白标记试剂盒由以下组分组成：2ul10*ntlabelingbuffer，2ul红色atto550ntlabelingmix或绿色atto488nt labelingmix。

19、更进一步地，步骤(5)中对目的基因组进行标记的标记过程为：jenabioscience荧光探针–蛋白标记试剂盒、10ul目的基因组dna溶液和2ulenzymemix4ulpcr-gradewater混匀后，进行pcr反应：15℃90min，65℃10min，4-12℃直至反应结束，体系设为20ul，取消pcr仪的盖子覆盖温度，pcr反应结束后，立即加入5ulstopbuffer终止反应，放-20℃保存备用。

20、作为优选地，步骤(6)中所述杂交液的制备过程为：于60℃水浴温度下，将1g硫酸葡聚糖钠盐溶于2mlddh20，然后与5mlfa、1ml20×ssc、1ml鲑鱼精dna混合即可。

21、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：

22、1、本发明提供了一种针对同一待测玻片连续进行nd-fish与gish检测的百合杂交种鉴定方法，nd-fish技术能够将荧光显示在染色体的不同部分和不同信号强度，所以通过荧光标记技术可以进行区分近端染色体，且能够更加准确的进行配对。而在百合组间杂交种鉴定的过程中，用gish技术进行鉴定工作能够对检测出亲本染色体和不同基因组之间的组间重组染色体，将两种技术进行结合能够精确定位亲本染色体在子代染色体中的位置，并且能够分析和观察百合非整倍体遗传规律，为后续百合亲本基因定位到具体染色体奠定基础；

23、2、本发明首次将nd-fish技术应用在百合杂交领域中，通过直接采用寡核苷酸探针，省去了探针的合成步骤，并且寡核苷酸探针较短，在进行探针标记时，更加经济实惠。且该技术杂交的过程中无需高温处理，且时长只需处理2小时，无需进行染色体变性，进而使得后续对染液进行清洗之后就能够继续对同一个分裂相使用gish技术进行杂交，从而得以将nd-fish与gish有机结合。