基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用的制作方法

本发明属于分子诊断，具体地说，本发明关于一种通过联合检测基因甲基化与突变，对结直肠癌进行诊断或筛查(包括辅助诊断或筛查)的方法和试剂。

背景技术：

1、结直肠癌是目前发病率很高的癌种，大多数的结直肠癌一旦发现即已属晚期——i期结直肠癌的5年生存率为90％，而发生远端转移的iv期结直肠癌5年生存率仅为14％，通过结直肠癌筛查和早诊早治可以有效降低结直肠癌的死亡率。

2、肠镜是目前最有效的结直肠癌筛查工具。但由于其侵入性，患者依从性较差——在一项相关研究中，接受调查的受试者，63％拒绝结直肠镜检查。此外，肠镜硬件设施及专科医生资源也远远不能满足大规模的筛查需求。粪便隐血检测则是目前另一种应用广泛的筛查工具，其无创、价廉的特点尤其适合大规模人群的筛查。但粪便隐血检测的灵敏度、特异性并不尽如人意。

3、对癌症基因组、转录组、表观遗传及蛋白组等的大量研究，揭示了在结直肠癌发生过程中，至少存在两类早期事件：原癌基因/抑癌基因突变导致对应基因异常的功能获得/丧失，以及抑癌基因启动子的异常甲基化导致的抑癌基因沉默，且癌症发生过程，存在多种环境因素的影响，并最终表现为多个基因的共同作用，存在很大的异质性。因此，需要多因素的选择和考虑，实现高灵敏度、高特异性的检测尤其困难。

4、目前的基因甲基化检测技术，通常需要通过一些化学试剂，如亚硫酸盐或重亚硫酸盐，对dna模板先进行处理，将甲基化/非甲基化的胞嘧啶，转化为pcr、测序等技术可以区分的碱基差异，从而实现检测的目的。但上述处理同时也改变了突变检测目标区段的整个序列，原有的基因突变检测体系不再适用。且该处理过程使得基因序列从四种不同的核苷酸的排列组合被大幅“简并”为几乎只有三种核苷酸，因而对后续扩增检测所必须的引物及探针设计带来很大困扰。因此，虽然pcr、测序等分子检测技术的发展，已使得多重检测在技术上成为可能，但现有产品往往只针对突变和甲基化这两种分子多态性中的一种，或者，需要采集两份生物检材，一份提取到的dna直接用于突变检测，另一份提取到的dna则进行重硫酸盐转化等处理，后续用于甲基化检测。这种方式，不单意味着更繁琐的操作、更大的失误几率、更高的成本及人员负荷、以及更长的检测周期，更重要的是，需要更多的原始检材。在某些情况下，可能造成由于原始检材量较少而不能够完成整个检测，降低检测成功率，影响临床诊断及治疗决策。

5、因此，迫切需要开发更有效的、可以基于一份生物检材、一次实验流程，对多个靶基因的甲基化水平及突变位点进行平行检测的方法，以实现更有效，且患者可及、负担得起的结直肠癌无创辅助诊断及早期筛查。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供甲基化标志物和点突变标志物的用途，用于作为诊断靶标、制备检测(包括诊断)结直肠癌的检测试剂或试剂盒，其中：(1)所述甲基化标志物为septin9、sdc2和mlh1的片段；其中，所述septin9含有如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述sdc2含有如seq id no:2所示的核苷酸序列，所述mlh1含有如seq id no:3所示的核苷酸序列；(2)所述点突变标志物为kras和braf的片段；其中，所述kras含有如seq id no:4所示的核苷酸序列，所述braf含有如seq id no:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：kras的g12和g13突变，braf的v600突变；其中，所述甲基化和突变标志物以亚硫酸盐转化产物为模板进行pcr扩增和检测。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述甲基化标志物septin9、sdc2和mlh1的片段不包括其全长序列。

4、在一种或多种优选实施方式中，所述突变标志物kras和braf的片段不包括其全长序列。

5、在一种或多种优选实施方式中，一种或多种甲基化和/或突变标志物同步扩增和检测。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述甲基化(修饰)包括5-甲基化修饰(5mc)。

7、在本发明的另一方面，提供特异性检测甲基化标志物和点突变标志物的检测试剂的用途，用于制备检测结直肠癌的试剂盒；其中，(1)所述甲基化标志物为septin9、sdc2和mlh1的片段；其中，所述septin含有如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述sdc2含有如seqid no:2所示的核苷酸序列，所述mlh1含有如seq id no:3所示的核苷酸序列；(2)所述点突变标志物为kras和braf的片段；其中，所述kras含有如seq id no:4所示的核苷酸序列，所述braf含有如seq id no:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：kras的g12和g13突变，braf的v600突变；其中，所述甲基化和突变标志物以亚硫酸盐转化产物为模板进行pcr扩增和检测。

8、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。

9、在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。

10、在一种或多种优选实施方式中，(1)和/或(2)中所述的检测试剂并合并使用，进行多重检测(如多重pcr检测)。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂是以血浆或血清为待测样本的诊断试剂，或以组织或细胞为待测样本的诊断试剂；较佳地是以血浆或血清为待测样本的诊断试剂。

12、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述引物和/或探针包括：用于septin9片段的甲基化水平检测：seq id no:7～8所示的引物对，seq id no:9所示的探针；用于sdc2片段的甲基化水平检测：seq id no:10～11所示的引物对，seq id no:12所示的探针；用于mlh1片段的甲基化水平检测：seq id no:13～14所示的引物对，seq id no:15所示的探针。

13、在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述引物和/或探针包括：用于kras的g12和g13突变检测：seq id no:16～20任一所示的正向引物(依次对应于g12s，g12r及g12c，g12d，g12a及g12v，g13d)、seq id no:21所示的反向引物，seq id no:22所示的探针；用于braf的v600突变(包括v600e)检测：seq id no:23～24所示的引物对，seq id no:25所示的探针。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂还包括内控基因的检测试剂；更佳地所述内控基因为gapdh或actb；更佳地，以seq id no:26～27所示的引物对，seq idno:28所示的探针作为所述内控基因的检测试剂。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述探针为荧光探针。

16、在一种或多种优选实施方式中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所属荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团包括但不限于：fam，rox，vic，joe，tamra，tet，cy5，cy3，texas red，hex中的任意一种；所述荧光淬灭基团包括但不限于mgb，bhq，eclipse，dabcyl中的任意一种。

17、在本发明的另一方面，提供一种用于检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒中包括：(1)特异性检测甲基化标志物的检测试剂，所述甲基化标志物为septin9、sdc2和mlh1的片段；其中，所述septin含有如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述sdc2含有如seq id no:2所示的核苷酸序列，所述mlh1含有如seq id no:3所示的核苷酸序列；和(2)特异性检测点突变标志物kras和braf的检测试剂；其中，所述kras含有如seq id no:4所示的核苷酸序列，所述braf含有如seq id no:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：kras的g12和g13突变，braf的v600突变。

18、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。

19、在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述的检测试剂为用于检测待测样本中所述点突变标志物的点突变存在情况试剂；较佳地，所述的检测试剂为引物和/或探针。

20、在一种或多种优选实施方式中，所述的检测试剂并合并使用，进行多重检测(如多重pcr检测)。

21、在一种或多种优选实施方式中，所述的检测结直肠癌的试剂盒的(1)中，所述引物和/或探针包括：用于septin9片段的甲基化水平检测：seq id no:7～8所示的引物对，seqid no:9所示的探针；用于sdc2片段的甲基化水平检测：seq id no:10～11所示的引物对，seq id no:12所示的探针；用于mlh1片段的甲基化水平检测：seq id no:13～14所示的引物对，seq id no:15所示的探针；(2)中，所述引物和/或探针包括：用于kras的g12和g13突变检测：seq id no:16～20任一所示的正向引物(依次对应于g12s，g12r及g12c，g12d，g12a及g12v，g13d)、seq id no:21所示的反向引物，seq id no:22所示的探针；用于braf的v600突变(包括v600e)检测：seq id no:23～24所示的引物对，seq id no:25所示的探针。

22、在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括内控基因的检测试剂；更佳地所述内控基因为gapdh或actb。

23、在一种或多种优选实施方式中，以seq id no:26～27所示的引物对，seq id no:28所示的探针作为所述内控基因的检测试剂。

24、在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂或组件：亚硫酸盐转化试剂，用于将核酸(dna)样本转化为适于甲基化水平检测的样本；较佳地，所述亚硫酸盐转化试剂包括：亚硫酸氢盐(如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵)、偏重亚硫酸盐(如偏重亚硫酸钠)、重亚硫酸盐(如重亚硫酸钠)或其组合。

25、在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂或组件：质控品；标准品；对照品；核酸提取试剂；dna扩增试剂；核酸序列分析软件；和/或说明操作方法的使用说明书。

26、在本发明的另一方面，提供一种检测(包括诊断)结直肠癌的方法，所述方法包括：

27、(i)检测待测核酸(dna)样本的甲基化标志物和点突变标志物；所述甲基化标志物为septin9、sdc2和mlh1的片段，所述septin含有如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述sdc2含有如seq id no:2所示的核苷酸序列，所述mlh1含有如seq id no:3所示的核苷酸序列；所述点突变标志物为kras和braf的片段，其中，所述kras片段含有如seq id no:4所示的核苷酸序列，所述braf片段含有如seq id no:5所示的核苷酸序列，所述点突变包括：kras的g12和g13突变，braf的v600突变；

28、(ii)分析(i)的检测结果，确定待测核酸样本中甲基化标志物的甲基化水平和点突变标志物的突变情况，任一甲基化标志物和点突变标志物存在甲基化或突变，则诊断为结直肠癌阳性。

29、在一种或多种优选实施方式中，对甲基化和突变标志物进行分析时，以亚硫酸盐或重亚硫酸盐处理，将核酸(dna)样本转化为适于甲基化和突变检测的样本。

30、在一种或多种优选实施方式中，通过pcr技术进行检测；较佳地，检测试剂包括前面所述的引物和/或探针。

31、在一种或多种优选实施方式中，所述的内控基因是gapdh或actb。

32、在一种或多种优选实施方式中，所述的方法为非诊断性的方法。例如，应用于在实验室中分析待测核酸样本的变异情况，或应用于不以诊断为目的的辅助性样本参数测定。

33、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。