一种应用于mNGS法检测病原微生物的去人源宿主试剂盒的制作方法

本技术涉及基因测序领域，具体地，涉及一种应用于mngs法检测病原微生物的去人源宿主试剂盒。

背景技术：

1、病原微生物感染是全球威胁人类健康的主要原因之一。对于感染性疾病，能否及时、有效的明确致病微生物，是临床抗生素合理用药、感染性疾病的流行性病原学监督与管理、控制感染传播的核心。目前，微生物感染在临床诊疗中的主要问题是不能及时准确的发现病原微生物以及经验性用药。感染性疾病相似的临床特征表现、复杂病原微生物以及免疫抑制宿主的增加，使微生物感染的临床治疗形势越来越严峻。因此，能否快速、准确的找出微生物感染的病原体成了目前感染性疾病治疗方面所面临的首要问题，它对于精准用药、缩短患者住院时间、减少住院费用、降低严重并发症及死亡发生率都发挥着举足轻重的作用。

2、目前，临床常规病原学诊断方法主要有培养法、镜检法、pcr法、免疫学法(包括荧光法、elisa法、层析法)、质谱法等。培养法作为临床公认的病原微生物检验的“金标准”，可适应较大样本体积、价格低廉，但是检测敏感度受限于培养时抗生素的使用，检测范围无法覆盖所有微生物及病毒，操作复杂、检测周期长且阳性率低，不适于临床广泛应用。镜检法，优势在于具有快速性、低成本，可检测多种微生物类型，包括细菌、真菌、寄生虫和病毒等，临床上适于初步鉴定。但检测结果易受到样本质量与操作者技能和经验的影响，对于数量较少的微生物可导致假阴性结果，仅能检测可观察的微生物。一代pcr法流程简单、快速、价格低，且可定量检测、准确性高，但是主观假设较强，仅能检测已知的微生物，扩增引物可靠性不稳定、只能检测微生物基因组的个别片段。免疫学法检测周期短，仅需1-3天，价格便宜，操作简单，检测范围包括支原体、衣原体、病毒等，但是敏感性和特异性差，并不是所有病原微生物都有相应抗体，存在窗口期，假阳性率高。质谱法流程简单、特异性强、准确性高，可进行高通量分析，但是需要基于已培养的阳性菌落，依赖培养法，且仅能检测细菌和真菌约1000种已知微生物，部分微生物不能鉴定到种，只能定性不能定量。因此，寻找新兴的、更快速、更灵敏和更准确的病原学检测技术成为临床诊断的核心环节。

3、高通量测序技术(next generation sequencing，ngs)以高输出量和高解析度为主要特色，其在病原微生物检测中的应用越来越普遍，可同时对数百万甚至数千万个感染性疾病病原体的dna/rna基因组进行序列读取，特别是在未知病原体引起疾病的情况下能够对病原微生物进行高通量测序，快速而精准地区分和鉴定病原微生物，从而指导临床用药和预后评估。其中，ngs技术中的宏基因组测序技术(metagenomics next generationsequencing，mngs)可以有效地检测复杂微生物群落中的病原微生物，以起到感染病原初筛及用药指导的作用。随着创新分子检测技术在临床转化及应用，mngs因具有耗时短、检测范围广且能提高病原微生物的检出率，受到临床检验的广泛关注。mngs相关应用规范及专家共识的相继出台，也推荐mngs方法对感染性疾病的诊断。

4、无论使用何种测序技术，都需要从所采集的样本中去除人源宿主，同时避免损伤病原体遗传物质，从而在测序时获得更多的病原体序列。目前常用的去宿主方法通过差异裂解法，先去除人源细胞dna，再将病原微生物细胞进行dna提取。常用的去宿主试剂组分过多，成分复杂，配制过程容易引入更多的外源dna，高浓度的盐离子对病原微生物也会造成损伤。处理的温度过高或时间过长，会造成目标病原微生物的dna破坏，反之，会导致去宿主不充分。

5、人源细胞较多的肺泡灌洗液和痰液样本，试剂与样本无法充分接触，需要实施样本液化。目前常用的液化方法有：(1)使用naoh溶液，反应剧烈，对核酸破坏较大；(2)酶解法反应时间较长，且无差别酶解，导致部分病原微生物被裂解而去除，影响病原微生物核酸的提取效率；(3)用二硫苏糖醇(dtt)作为反应还原剂，但反应效率低，样本液化效果差，且dtt稳定性较差，不利于长期保存，配制耗时较长。

技术实现思路

1、本技术提出了一种去人源宿主试剂盒，包括去宿主试剂，所述去宿主试剂含有体积浓度2.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量浓度5％的皂素。

2、作为优选，所述试剂盒还包括消化缓冲液，所述消化缓冲液含有0.8m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15-0.17m氯化镁和0.1m二硫苏糖醇。其中氯化镁溶液浓度可以进一步优选为0.16m。所述消化缓冲液的体积为所述去宿主试剂的8-10倍。

3、作为优选，所述试剂盒还包括dnase i酶。

4、作为另一种优选，所述试剂盒还包括样本液化试剂，所述样本液化试剂为0.5％胰蛋白酶溶液。

5、作为优选的一种实施方式，所述试剂盒中包括一个或多个基础套装，每个基础套装含有30μl去宿主试剂，330μl消化缓冲液，9u的dnase i酶。

6、本技术还提供一种去除人源宿主的方法，包括以下步骤：

7、步骤1，液化待测样本，液化完成后，离心收集沉淀；

8、步骤2，pbs重悬沉淀，加入去宿主试剂、消化缓冲液和dnase i酶，所述去宿主试剂含有体积浓度2.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量浓度5％的皂素，所述消化缓冲液含有0.8m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15-0.17m氯化镁和0.1m二硫苏糖醇。其中氯化镁溶液浓度可以进一步优选为0.16m。所述消化缓冲液的体积为所述去宿主试剂的8-10倍，混匀后于37℃孵育；

9、步骤3，加热至80℃保温1min，冷却至室温，离心，弃上清。

10、作为优选，所述步骤1中，使用所述待测样本对于每400-600μl的样本，使用750μl的0.5％胰蛋白酶溶液，在37℃下液化20min，完成待测样本的液化。

11、作为优选，所述步骤2中试剂的用量为，所述步骤2中试剂的用量为，对于每400-600μl的样本，使用0.03ml的去宿主试剂，0.33ml的消化缓冲液和9u的dnase i酶。

12、作为优选，所述步骤2中37℃孵育时间为20min。

13、本技术还提供所述的试剂盒的用途，所述用途为在mngs法检测微生物病原体中去除人源宿主。

14、本技术中的样本，为医院检测病原微生物时采样的样本，根据感染部位的不同，可以为痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液等。

15、本技术中的triton x-100为聚乙二醇辛基苯基醚，saponin为皂素，tris-hcl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，dtt为二硫苏糖醇，均有市售试剂。本技术中的试剂，如无特别说明，均使用市售试剂。本技术中的溶液，胰蛋白酶溶液使用pbs作为溶剂，其他溶液如无特别说明，溶剂为去核酸水。

16、本技术对体积、时间、浓度等参数进行限定的数值，并不局限于特定的点值，如四舍五入后与本技术数值相同的，应视为落入本技术保护范围。例如，2.5％实质上涵盖了≥2.45％且＜2.55％的范围，5％则实质上涵盖了≥4.5％且＜5.5％的范围。

17、本技术中表示单位的m，含义为mol/l，mm含义为mmol/l，即10-3mol/l；min含义为分钟；u为酶活性单位。本技术中，如无特别说明，使用m、mm、xx％等形式限定某物质时，含义为所述物质的所述浓度溶液。使用％表示浓度时，如溶质常温常压下为液态，则百分比浓度表示体积百分比，如溶质常温常压下为固态，则百分比浓度表示质量百分比。

18、本技术技术方案的优点在于，通过人源宿主的去除，提高病原微生物基因组在样本总基因组中的比例。提高目的病原微生物的检出，保障检测结果的准确性，为临床医生快速诊断感染性疾病提供有效依据。

19、在一种优选的实施方式中，通过改进样本液化处理试剂和方法，使得样本中病原微生物得到分散，有利于后续的消化。

20、在另一种优选的实施方式中，通过对现有的去宿主试剂进行调整，减少试剂的组分以避免引入更多的外源dna，避免高浓度的盐离子的使用对样本核酸的损伤，调整各组份的用量及比例，优化dnase消化酶用量，优化人源宿主去除效果。

21、在另一种优选的实施方式中，通过优化人源宿主去除处理温度，避免去宿主方法的处理温度过高，会造成目标病原微生物的dna破坏；同时也避免去宿主的温度过低，会导致去宿主不充分。

22、在另一种优选的实施方式中，通过优化人源宿主去除处理时间，避免去宿主方法的处理时间过长，会造成目标病原微生物的dna破坏；同时也避免去宿主的时间过短，会导致去宿主不充分。