一株猪多杀性巴氏杆菌A型菌株、由其制备的疫苗和应用

本发明涉及一种猪多杀性巴氏杆菌a型菌株，以及由该菌株制备的猪巴氏杆菌病灭活疫苗及其应用，属于兽用生物制品。

背景技术：

1、多杀性巴氏杆菌是巴氏杆菌科巴氏杆菌属的重要致病菌，为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，最适生长温度是37℃，在含动物血液的培养基中存活能力更强。1878年perroncito首次发现巴氏杆菌；1880年，louis pasteur首次从禽霍乱病例中分离出该病原菌，并确定其是造成禽霍乱的病原体；后续相继在牛、兔、猪等多种动物的感染病例中出现。1920年，该病原菌首次被报道能引起人的感染；1938年，该病原菌被正式命名为多杀性巴氏杆菌。依据荚膜抗原，多杀性巴氏杆菌分为5种荚膜血清型(a、b、d、e和f)。

2、多杀性巴氏杆菌感染仔猪引起猪肺疫，即猪巴氏杆菌病，呈现以严重的胸膜肺炎、关节炎和败血症为特征。在20世纪90年代之前，猪肺疫是中国猪群中流行率、死亡率最高的三大传染病(猪瘟、猪丹毒和猪肺疫)之一，目前在我国以及世界各养猪国家仍然爆发，严重危害养猪业的健康发展。在我国猪群中，多杀性巴氏杆菌曾以b型和a型为主，d型少见。但是近年来的研究发现a型和d型为主要流行血清型，而b型罕见。

3、我国对于猪巴氏杆菌病的防控技术相对滞后，主要使用的仍是20世纪中期研制的传统疫苗，猪巴氏杆菌病灭活疫苗(b型c44-1株)和猪巴氏杆菌病活疫苗(b型eo630株)等，传统疫苗菌株血清型与当前流行血清型不符，我们最新的研究表明其不能提供针对a型和d型菌株的有效交叉保护。因此，研发针对我国当前流行的a型强毒菌株、且免疫效力强的多杀性巴氏杆菌灭活疫苗是预防和控制猪巴氏杆菌病的必然要求。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种猪多杀性巴氏杆菌a型菌株。

2、同时，本发明还提供一种由上述猪多杀性巴氏杆菌a型菌株制备的猪巴氏杆菌病灭活疫苗。

3、最后，本发明还提供一种猪多杀性巴氏杆菌a型菌株在制备猪巴氏杆菌病灭活疫苗中的应用。

4、为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

5、猪多杀性巴氏杆菌a型菌株，其名称为多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)hl，保藏编号：cctccno:m2023629，保藏日期：2023年04月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

6、本发明中猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)分离自猪肺疫死亡的育肥猪的心血中，毒力强，其针对8–9周龄仔猪的致死剂量(absolute lethal dose,ld100)、半数致死剂量(50％lethal dose,ld50,ld50)和发病剂量(absolute morbility dose,md100)分别为2.0×107cfu、6.6×106cfu和2.2×106cfu。将该菌株在含0.5％胎牛血清和0.5％裂解血球全血的tsa培养基上，37℃培养24–48小时，可长成无色透明、湿润光滑、中央隆起的圆形单菌落，在阳光下菌落泛蓝光；革兰氏阴性菌，两极浓染、中间微凸的短杆状或球杆状，有时会出现多个细菌接连在一起，形成长丝状；经血清型鉴定为a型，可制成灭活疫苗用于预防当前流行的a型菌株感染。

7、猪巴氏杆菌病灭活疫苗，其抗原为灭活的猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)。

8、进一步的，所述猪巴氏杆菌病灭活疫苗中还含有氢氧化铝胶佐剂(佐剂的含量为20％，体积百分数)。

9、进一步的，所述猪巴氏杆菌病灭活疫苗中还含有防腐剂，如0.005％的硫柳汞(体积百分数)、0.3％的苯酚(体积百分数)等。

10、进一步的，所述灭活可采用常规的灭活剂，如甲醛、β-丙内酯(bpl)等。

11、进一步的，在1ml猪巴氏杆菌病灭活疫苗中，猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)的灭活菌体含量为6.0×109cfu/ml。

12、猪巴氏杆菌病灭活疫苗的用法及用量：颈部肌肉注射，(按瓶签注明头份)不论猪只大小，每次均注射1头份(2ml)。仔猪在3–4周龄首免，3周后再次免疫；母猪在产前8–9周首免，3周后二免，以后每胎产前5–6周免疫一次。

13、本发明中猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)接种于适宜培养基中纯化培养后，再接种于液体培养基(如tsb)中增殖培养，培养液经(甲醛)灭活后，离心收集菌体加入氢氧化铝胶佐剂乳化制成灭活疫苗，该灭活疫苗能有效预防a型猪多杀性巴氏杆菌引起的猪巴氏杆菌。同时，该灭活疫苗的安全性良好，疫苗免疫后仔猪没有出现接种部位红肿和发热，及死亡等症状。

14、猪多杀性巴氏杆菌a型菌株在制备猪巴氏杆菌病灭活疫苗中的应用。具体的，猪巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

15、1)将猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)的菌液进行灭活；

16、2)将灭活后的菌液浓缩去除上清，洗涤后稀释，得到抗原液；

17、3)将抗原液与佐剂、防腐剂混合均匀，即得。

18、步骤1)中，所述菌液中猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)的活菌含量为2.5×109cfu/ml。

19、步骤2)中，所述灭活采用甲醛灭活剂，甲醛灭活剂按照菌液总量的0.10％–0.15％(体积分数)加入浓度为37％–40％的甲醛溶液；37℃灭活24–48小时。

20、步骤2)中，所述洗涤、稀释均可采用无菌pbs溶液(0.0l mol/l、ph值7.2)；洗涤后用无菌pbs溶液稀释菌体抗原(即灭活的猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)，浓度为7.5×109cfu/ml。

21、步骤3)中，所述抗原液与氢氧化铝胶佐剂按照4:1的体积比混合；室温下500–800r/min搅拌20–30min，至其混合均匀。

22、步骤3)中，所述防腐剂是按照0.005％(体积百分数)的量加入硫柳汞，或者按照0.3％(体积百分数)的量加入苯酚。

23、步骤3)中，所述猪巴氏杆菌病灭活疫苗中含灭活的猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)的菌体含量为6.0×109cfu/ml。

24、本发明中猪巴氏杆菌病灭活疫苗的制备工艺简单，对猪的安全性良好，能同时保护免疫猪抵抗a型猪多杀性巴氏杆菌感染。

25、本发明的有益效果：

26、在我国猪群中，猪巴氏杆菌病是一种重要的细菌性传染病。我国对于猪巴氏杆菌病的防控技术相对滞后，传统疫苗菌株血清型与当前流行血清型不符，且对当前流行毒株没有免疫保护作用。因此，研发针对我国当前流行的a型菌株的多杀性巴氏杆菌灭活疫苗势在必行。本发明中猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)于2017年10月18日分离自河南患病猪群，经血清型鉴定为a型。通过对猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)制成的灭活疫苗进行大量的动物免疫保护试验，证明该灭活疫苗的免疫效果良好，可以有效预防当前流行的a型菌株感染。

27、本发明以优势流行菌株猪多杀性巴氏杆菌a型菌株hl(cctccno:m2023629)作为疫苗制备菌株，接种于tsb液体培养基(含0.5％胎牛血清)中培养，收获培养物，经甲醛灭活后，加入佐剂混合制成猪巴氏杆菌病灭活疫苗，该疫苗可用于预防a型猪多杀性巴氏杆菌引起的猪肺疫，并且具有安全性好、免疫效力高、免疫期长等优点。

28、保藏证明和存活证明说明

29、保藏菌株：多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)hl，保藏编号：cctccno:m2023629，保藏日期：2023年04月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。