一种鉴别PCV2与PCV3的nfo-RPA检测试剂盒的制备方法

本发明涉及一种检测试剂盒的制备方法，更具体一点说，涉及一种鉴别pcv2与pcv3的nfo-rpa检测试剂盒的制备方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

1、猪圆环病毒(pcv)是一种小、无包膜的环状dna病毒，在猪中已经鉴定出四种不同的pcv，根据其发现顺序用连续的数字命名，猪圆环病毒1型(pcv1)，猪圆环病毒2型(pcv2)，猪圆环病毒3型(pcv3)和猪圆环病毒4型(pcv4)。其中，普遍认为pcv1非致病性，pcv2和pcv3与临床表现最相关，而pcv4没有明确的疾病。猪圆环病毒2型(pcv2)被认为是对养猪业产生重大经济影响的病毒之一，而猪圆环病毒3型(pcv3)被发现与猪皮炎和肾病综合征(pdns)样疾病有关，两种病毒在临床上容易合并感染。pcv在全球猪群中无处不在，很少发现未感染的猪群，对世界养猪业造成严重损害，给全球养猪业造成巨大的经济损失。

2、pcv检测的快速诊断工具在疾病控制和根除中起着重要的作用，如何快速有效地检测pcv的感染对猪场有效防控该病具有极其重要的意义。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有检测特异性高，检测结果符合率高，适用于临床快检等技术特点的一种鉴别pcv2与pcv3的nfo-rpa检测试剂盒的制备方法。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明一种鉴别pcv2与pcv3的nfo-rpa检测试剂盒的制备方法：

4、1)阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出pcv2和pcv3的基因片段，并从pcv3和pcv2基因组中扩增出相应的基因片段并连接到puc57质粒中构建阳性质粒；

5、2)建立nfo-rpa反应体系：根据pcv2和pcv3的基因片段序列分别设计nfo-rpa酶扩增引物，将引物和探针与nfo-rpa酶混合建立反应体系；

6、3)确定nfo-rpa反应体系最佳检测时间和温度。

7、优选的，阳性质粒的制备具体为：

8、利用分子生物学方法将扩增的pcv2与pcv3基因片段进行双酶切后连接到puc57载体中，转入escherichia coli top10感受态菌中扩增，筛选鉴定后获得的重组载体命名为pcv2和pcv3阳性质粒。

9、优选的，pcv3基因片段序列如no.1所示：

10、no.1pcv3基因片段：

11、ataccactttttctccctacagacctccgtggatccgggttccgaggtgccgggtaatactagcccggcaccaaaatgagacacagagctatattcagaagaagaccccgcccaaggagacgacgacgccacagaaggcgctatgccagaagaagactattcattaggaggcccacagctggcacatactacacaaagaaatactccaccatgaacgtcatatccgttggaacccctcagaataacaagccctggcacgccaaccacttcattacccgcctaaacgaatgggagactgcaattacctttgaatattataagatactaaagatgaaagttacactcagccctgtaatttctccggctcagcaaacaaaaactatgttcgggcacacagccatagatctagacggcgcctggaccacaaacacttggctccaagacgacccttatgcggaaagttccactcgtaaagttatgacttctaaaaaaaaacacagccgttacttcacccccaaaccacttctggcgggaactaccagcgctcacccaggacaaagcctcttctttttctccagacccaccccatggctcaacacatatgaccccaccgttcaatggggagcactgctttggagcatttatgtcccggaaaaaactggaatgacagacttctacggcaccaaagaagtttggattcgttacaagtccgttctctaagtgaaaataaatataaatctgacccctccggtggcgacaagccgtgtcccctcgcgcgcgctcccgctgcg。

12、优选的，pcv2基因片段序列如no.2所示：

13、no.2pcv2基因片段：

14、accagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcacctcagcagcaacatgcccagcaagaagaatggaagaagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttggcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttcgctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgctgctacatcgagaaagccaaaggaactgatcagcagaataaagaatattgcagtaaagaaggcaacttacttattgaatgtggagctcctcgatctcaaggacaacggagtgacctgtctactgctgtgagtaccttgttggagagcgggagtctggtgaccgttgcagagcagcaccctgtaacgtttgtcagaaatttccgcgggctggctgaacttttgaaagtgagcgggaaaatgcagaagcgtgattggaagaccaatgtacacgtcattgtggggccacctgggtgtggtaaaagcaaatgggctgctaattttgcagacccggaaaccacatactggaaaccacctagaaacaagtggtgggatggttaccatggtgaagaagtggttgttattgatgacttttatggctggctgccgtgggatgatctactgagactgtgtgatcgatatccattgactgtagagactaaaggtggaactgtaccttttttggcccgcagt。

15、优选的，所述引物包括如下：

16、pcv3-forward ggcacatactacacaaagaaatactccacc；

17、pcv3-reverse[dig]atattcaaaggtaattgcagtctcccattcg；

18、pcv3-probe[fitc]gttggaacccctcagaataacaagccctgg[dspacer]；

19、cacgccaaccacttcattaccc[c3spacer]；

20、pcv2-forward gctgccgtgggatgatctactgagactgtgt；

21、pcv2-reverse[biotin]cagggcatgggggggaaagggtgacgaactg；

22、pcv2-probe[6-fam]ggcccgcagtattctgattaccagcaatca[dspacer]gaccccgttggaatggtactcc[c3spacer]；

23、dig表示地高辛，biotin表示生物素，fitc表示异硫氰酸荧光素，fam表示荧光报告基团，spacer表示间臂。

24、优选的，nfo-rpa反应体系的建立包括：建立pcv2 nfo-rpa反应体系和建立pcv3nfo-rpa反应体系；

25、建立pcv2 nfo-rpa反应体系：在nfo-rpa干粉管中分别加入29.4μl buffer a、2μlpcv3-specific-forward、2μlpcv3-specific-reverse、0.6μlpcv3-specific-probe以及共13.5μl的ddh2o和cap阳性质粒，2.5μl的buffer b，在39℃反应9min后，取反应产物40μl清洁回收后进行琼脂糖凝胶电泳，其余10μl产物稀释1/50倍后，取10μl滴加到胶体金试纸条加样区，观察胶体金试纸条的检测结果，同理，建立pcv2 nfo-rpa反应体系。

26、优选的，确定nfo-rpa反应体系最佳检测时间和温度：

27、选取稀释浓度为1×108copies/μl的pcv3阳性质粒模板，分别设置时间梯度8min、9min、10min、11min、12min进行nfo-rpa扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，采用可见清晰的扩增条带的反应时间以作为最佳检测时间；

28、在选出最佳检测时间的基础上，进一步设置温度梯度37℃、38℃、39℃进行nfo-rpa扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。

29、优选的，最佳检测时间为9min；最佳反应温度为39℃。

30、优选的，还包括nfo-rpa反应体系灵敏度验证包括；

31、以pcv3阳性质粒标准品1×109copies/μl为初始浓度，按10倍梯度稀释，在反应时间为9min，反应温度为39℃的反应条件下分别以稀释浓度为1×109copies/μl、1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl、1×101copies/μl、1×100copies/μl的cap阳性质粒为模板，ddh2o为阴性对照进行nfo-rpa扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果；

32、以pcv2阳性质粒标准品1×106copies/μl为初始浓度，按10倍梯度稀释，在反应时间为9min，反应温度为39℃的反应条件下分别以稀释浓度为1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl、1×101copies/μl、1×100copies/μl、1×10-1copies/μl、1×10-2copies/μl、1×10-3copies/μl、1×10-4copies/μl、1×10-5copies/μl、1×10-6copies/μl的pcv2阳性质粒为模板，ddh2o为阴性对照进行nfo-rpa扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果。

33、优选的，还包括nfo-rpa反应体系重复性验证包括：

34、组间重复：以1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl3个不同浓度的pcv3阳性质粒在同一条件下进行3次重复检测；

35、组内重复：以1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl3个不同浓度的pcv3阳性质粒在同一次实验中做3次重复；

36、组间重复：以1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl3个不同浓度的pcv2阳性质粒在同一条件下进行3次重复检测；

37、组内重复：以1×108copies/μl、1×107copies/μl、1×106copies/μl3个不同浓度的pcv2阳性质粒在同一次实验中做3次重复。

38、优选的，还包括nfo-rpa反应体系特异性鉴定包括：

39、分别以猪肺炎支原体168株、猪圆环病毒2型、猪细小病毒及伪狂犬病毒的基因组为模板，ddh2o为阴性对照，在反应时间9min，反应温度39℃进行pcv3 nfo-rpa反应，并在胶体金试纸条中观察结果；

40、分别以猪肺炎支原体168株、猪圆环病毒3型、猪细小病毒及伪狂犬病毒的基因组为模板，ddh2o为阴性对照，在反应时间9min，反应温度39℃进行pcv2 nfo-rpa反应，并在胶体金试纸条中观察结果。

41、有益效果：本技术检测试剂盒的反应体系仅需在39℃反应9min，反应重复性好，检测特异性高，反应结果在5min内即可通过胶体金试纸条呈现，且检测结果与pcr检测结果符合率为84.17％；构建的鉴别pcv2与pcv3的nfo-rpa检测试剂盒适用于临床快检。