pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的组合物及应用的制作方法

本发明涉及基因编辑，尤其是涉及一种papn突变体和用于papn基因定点修饰的组合物及应用。

背景技术：

1、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，tge)是仔猪发病和死亡的最主要疫病之一，是世界动物卫生组织要求的必须严格检疫的猪传染性疾病。tge的潜伏期很短，传播速度快，发病急，在不同品种不同年龄的猪群都可快速建立感染。2周龄以下的小猪感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，tgev)后的死亡率极高，尤其是小于10日龄的仔猪致死率可达100％。因此tge被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。

2、tgev可与宿主细胞发生特异性结合，首先病毒s蛋白的s1部分作为识别位点可以特异性识别宿主细胞表面受体，随后s蛋白发生构象变化，使得病毒与细胞膜发生融合作用。广泛存在于小肠上皮细胞表面的papn蛋白是tgev感染宿主细胞的重要受体，同时唾液酸作为辅助因子，对tgev的黏附起重要作用，唾液酸有助于黏附更多的病毒粒子并促进病毒穿越小肠上皮粘液层，保护病毒免受乳化破坏。

3、但是，除了在介导tgev入侵方面发挥着重要作用外，papn在小肠中还发挥水解肽、酰胺等结构中的酰胺键从而参与多种肽代谢，在细胞生长、免疫调节和血压调节中具有重要作用。此外，apn与肿瘤的侵袭、迁移和免疫细胞趋化等密切相关，因此直接对papn进行敲除可能影响机体的其他生理功能。

4、删除或突变受体分子介导病毒进入宿主细胞的关键功能域或关键氨基酸，使受体丧失介导病毒进入细胞的能力，同时最大程度上保留其维持细胞正常生命活动的功能，是最好的以受体分子为靶分子建立抗tgev感染的策略。crispr/cas9基因编辑技术作为新一代基因编辑技术，可实现基因的“精准”编辑，这为抗tgev基因编辑猪的构建提供了有利的工具。因此，开发一种papn基因关键位点精准突变，其既能保持papn蛋白正常表达，又能够抵抗tgev感染的精准基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种papn突变体，该papn突变体的734位为丙氨酸，表达该papn突变体蛋白的机体具有抗tgev的能力。

2、本发明的第二目的在于提供编码上述papn突变体的多核苷酸。

3、本发明的第三目的在于提供用于papn基因定点修饰的组合物。

4、本发明的第四目的在于提供上述用于papn基因定点修饰的组合物的应用。

5、本发明的第五目的在于提供一种非疾病和诊断治疗目的的papn基因定点修饰的细胞的制备方法。

6、本发明的第六目的在于提供一种papn突变的细胞。

7、本发明的第七目的在于提供一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法。

8、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

9、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种papn突变体，该papn突变体的734位为丙氨酸。

10、优选地，所述papn突变体由氨基酸序列如seq id no：1所示，或，与包含与seq idno：1至少80％同一性的氨基酸序列的papn突变得到；

11、优选地，所述papn突变体为seq id no：1所示的氨基酸序列的734位由苏氨酸突变为丙氨酸的多肽。

12、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种编码上述papn突变体的多核苷酸。

13、优选地，编码papn的734位突变的多核苷酸序列为gcc。

14、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于papn基因定点修饰的组合物，该组合物包括第一sgrna、第二sgrna和供体dna；第一sgrna和第二sgrna分别靶向papn基因的两个靶位点；

15、供体dna含有papn基因第734位氨基酸的定点修饰片段，且所述定点修饰片段位于所述两个靶点之间，所述供体dna使papn的t734突变为a734；

16、优选地，所述供体dna使编码papn基因第734位的核苷酸序列为gcc；

17、优选地，供体dna的核苷酸序列如seq id no：4所示；

18、优选地，编码第一sgrna的核苷酸序列如seq id no：2所示；

19、优选地，编码第二sgrna的核苷酸序列如seq id no：3所示。

20、优选地，所述组合物包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括表达所述第一sgrna的表达盒；所述第二载体包括表达所述第二sgrna的表达盒；

21、优选地，所述第一载体还包括基因编辑蛋白表达盒；

22、优选地，所述第二载体还包括基因编辑蛋白表达盒；

23、优选地，所述第一载体表达的基因编辑蛋白和所述第二载体表达的基因编辑蛋白分别独立的包括cas9、cas9n、cpf1或c2c2，进一步分别独立的优选为cas9；

24、优选地，所述第一载体和所述第二载体的骨架分别独立的来源于px330、px260、px334、px335、px458、px459、px461、px462、px551或px552；进一步分别独立的优选为px458。

25、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述用于papn基因定点修饰的组合物在如下(a)～(c)任意一项中的应用；

26、(a)非疾病和诊断治疗目的的构建papn基因定点修饰的细胞系；

27、(b)制备预防猪传染性胃肠炎的产品；

28、(c)非疾病和诊断治疗目的的构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型。

29、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非疾病和诊断治疗目的的papn基因定点修饰的细胞的制备方法，该制备方法包括向目的细胞导入上述组合物，得到papn基因定点修饰的细胞；

30、优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞或猪回肠上皮细胞；

31、优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法；进一步优选为电穿孔法。

32、优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到papn基因定点修饰的细胞；

33、优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞；

34、优选地，所述鉴定包括测序鉴定或pcr鉴定；

35、优选地，使用seq id no：14～15所示引物进行pcr鉴定。

36、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种papn突变的细胞，该细胞表达上述papn突变体；或，含有上述多核苷酸；或，由上述制备方法制备得到的细胞。

37、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法，该制备方法包括将上述细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得papn基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；

38、或，通过显微注射的方法，将上述组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到papn基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得papn基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；

39、优选地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；

40、优选地，所述鉴定包括测序鉴定或pcr鉴定；

41、优选地，使用seq id no：14～15所示引物进行pcr鉴定。

42、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

43、本发明提供的papn突变体的734位为丙氨酸，能够维持papn自身正常表达，同时降低表达该papn突变体的宿主与tgev发生特异性结合的能力。

44、本发明提供的用于papn基因定点修饰的组合物包括第一sgrna，第二sgrna和供体dna，该组合物能够对papn基因的两个靶位点进行有效酶切，利用供体dna的定点修饰片段替换位于两个靶位点之间的第734位氨基酸，实现papn第734位氨基酸的精准突变。在精确修饰papn基因的同时，能够避免破坏或改变papn基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗tgev感染的基础上，最大程度上保留papn蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

45、利用上述组合物得到papn基因定点修饰的细胞的制备方法，具有方法操作简单、成本低廉的优势，且细胞中papn基因第734位氨基酸能够被准确修饰。利用papn突变的细胞得到的基因编辑猪的制备方法，具有操作方便，普适性强的优势，且制备得到的第734位氨基酸基因编辑猪具有良好的tgev抗性同时保留了papn蛋白正常表达。