脂滴靶向检测H2S的荧光探针、制备方法和应用及定量检测外源性H2S的方法

本发明属于有机荧光探针领域，具体涉及一种脂滴靶向检测h2s的荧光探针、制备方法和应用及定量检测外源性h2s的方法。

背景技术：

1、硫化氢(h2s)作为一种重要的生物信号分子，近年来在生物学领域和相关的跨学科研究中得到了广泛的关注。它在哺乳动物和植物系统的各种生理和病理生理过程中起着至关重要的作用。内源性h2s的异常浓度已被证明与多种疾病的产生密切相关，包括阿尔茨海默病(ad)、肺动脉高压、糖尿病和癌症。最近的研究也揭示了在植物系统中h2s对种子萌发、营养生长、器官发生、生殖生长、产量以及衰老等过程具有一定影响。此外，h2s在不同环境条件下还可调节psⅱ有效光化学量子产量、电子传递速率、叶绿素含量、净光合速率、气孔打开/关闭和蒸腾速率等光合性状。

2、脂滴不仅与中性脂质储存和脂质代谢高度相关，而且还与信号转导、蛋白质降解、维持细胞能量稳态和细胞凋亡等各种重要的生理过程高度相关。脂滴作为一种生物标志物，脂滴功能障碍可导致多种疾病，包括动脉粥样硬化、癌症、2型糖尿病和神经退行性变等。此外，最近的研究表明，h2s在调节细胞脂滴的大小和数量方面起着重要作用。因此，追踪和定量脂滴中的h2s将有助于揭示相关疾病的发病机制。

3、荧光成像是目前监测少量h2s最强大的技术之一，作为一种无创技术，具有优异的灵敏度、易于操作、实时检测和高时空分辨率。在近些年的研究中，细胞器靶向探针的发展使亚细胞微环境的实时监测成为可能。这些努力促进了对h2s的生理和病理功能的探索。然而，到目前为止，开发用于检测活性硫物种，尤其是气体发射器h2s的脂滴靶向的探针非常有限。据调研，因为大部分荧光探针为了具有良好的细胞渗透性，提高了脂溶性，导致探针的水溶性较差，致使探针无法成功运用于完全含水的植物系统中。因此，开发灵敏和选择性的脂滴靶向探针来检测动物细胞内h2s、同时也可以检测植物细胞内h2s仍然是一个挑战。

技术实现思路

1、本发明首次构建了脂滴靶向既可检测动物细胞内源性h2s、同时也可以检测植物细胞内源性h2s的荧光探针，该荧光探针对h2s表现出显著的选择性和敏感性，具有荧光和脂滴靶向的优势，已成功地应用于肿瘤组织和拟南芥幼苗中h2s的生物成像。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、脂滴靶向检测h2s的荧光探针，该荧光探针的具体结构式如下：

4、

5、作为本发明的优选，该荧光探针的荧光信号在ph 6-10的环境下增强，λex＝488nm、λem＝500-600nm。

6、本发明还提供上述脂滴靶向检测h2s的荧光探针的制备方法，该方法合成途径简洁，操作简单，具体包括以下步骤：

7、步骤s1：将4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛、1-氟-2,4-二硝基苯和碳酸钾溶于溶剂中，在常温常压下搅拌反应；

8、步骤s2：将步骤s1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈溶于溶剂中，加入三乙胺，在氮气保护下常温常压搅拌反应，制备得到荧光探针。

9、作为本发明的优选，步骤s1中4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛和1-氟-2,4-二硝基苯的物质的量之比为1～2：1～10；步骤s1反应所用的溶剂为n,n-二甲基乙酰胺，反应时间为2～36h；反应后需要通过硅胶色谱纯化，硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1～20：1～2。

10、作为本发明的优选，步骤s2中步骤s1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈的物质的量之比为1～2：1～10；步骤s2反应所用的溶剂为二氯甲烷，反应时间为2～36h；反应后需要通过硅胶色谱纯化，硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1～20：1～2。

11、本发明提供的荧光探针可以与活的hela细胞兼容，对脂滴具有较高的特异性，可以敏感地监测活细胞内源性h2s的水平，因此可以在制备检测细胞内源性h2s的试剂中应用，所述细胞包括动物细胞、植物细胞。

12、另外，本发明使用脂滴靶向检测h2s的荧光探针可视化癌细胞，发现癌细胞中的荧光信号明显强于正常细胞，表现出超过三倍的荧光增强，这是因为癌细胞中h2s水平相对较高；因此，脂滴靶向检测h2s的荧光探针可用作区分癌细胞与正常细胞的有效探针。

13、本发明还使用脂滴靶向检测h2s的荧光探针可视化动物癌组织，发现肿瘤组织表现出明显明亮的荧光信号，而在正常组织中可以检测到非常微弱的荧光，这是因为肿瘤组织中h2s水平明显高于正常组织，因此脂滴靶向检测h2s的荧光探针是癌症特异性的，可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。

14、作为本发明的优选，所述癌症包括宫颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌。

15、本发明还使用脂滴靶向检测h2s的荧光探针对作物植株中的h2s进行了监测，将拟南芥幼苗与探针btda-h2s共孵育2h后，可以明显地观察到荧光信号，证明该探针可以实现植物组织中h2s水平的成像；因此，可以在制备检测植物组织中h2s的试剂中应用。

16、本发明还提供一种定量检测外源性h2s的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

17、步骤s1、将含h2s的水样加入比色皿中，再加入脂滴靶向检测h2s的荧光探针，之后使用荧光手电筒照射比色皿，此时溶液会显示不同颜色；

18、步骤s2、捕捉彩色图像，并通过颜色识别模块读取彩色图像的rgb值；

19、步骤s3、根据彩色图像的g/b比值，计算h2s的含量，计算公式如下：

20、g/b＝0.0224ch2s+0.4237

21、步骤s4、输出检测结果。

22、本发明的优点和有益效果：

23、(1)本发明首次构建了一种脂滴靶向既可以检测动物细胞内源性h2s、同时也可以检测植物细胞内源性h2s的荧光探针，该荧光探针具有优越的脂滴靶向能力，对h2s具有较高的选择性，检测限低(1.563μm)，并且不受其它干扰物质的影响。

24、(2)本发明提供的荧光探针的荧光强度在ph 7.0到ph 10.0保持稳定，适合用于生理ph值的成像；另外，该探针的合成途径简洁，操作简单。

25、(3)本发明提供的荧光探针可用于区分癌细胞/组织与正常细胞/组织，还可用于癌症患者手术标本的诊断，其可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。

26、(4)本发明提供的荧光探针可以实现植物组织中h2s水平的成像，因此，可以在制备检测植物组织中h2s的试剂中应用。

27、(5)本发明提供的荧光探针可以与活细胞兼容，对脂滴具有较高的特异性，可以敏感地监测活细胞内源性h2s的水平，可以在制备检测细胞内源性h2s的试剂中应用。

28、(6)本发明的btda-h2s探针与不同浓度的h2s混合时，可以很容易地监测颜色的变化，且彩色图像的g/b比值与h2s的量呈良好的线性关系，因此可以将btda-h2s探针与智能手机的结合定量检测外源性h2s。

29、(7)本发明首次提出了通过rgb值可视化定量检测外源性h2s的方法，为外源性h2s的检测和定量提供了一种简单、高效、低成本的方法。